Ошибки при проведении пцр анализа

Команда «Биокор Текнолоджи» разрабатывает тест-системы и наборы для молекулярной диагностики методом ПЦР, и расскажет в этом материале, на какие детали стоит обратить внимание для предотвращения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

ПЦР является универсальным методом лабораторной диагностики, позволяющим идентифицировать даже не собственно вирус или бактерию в биологическом материале, а участки их РНК или ДНК.

Чувствительность ПЦР-анализа приближается к 10-100 копиям генетического материала возбудителя на реакцию. Для сравнения, если человек находится в активной фазе развития заболевания, то его биологический материал содержит миллионы геномов возбудителя на миллилитр, что, после выделения нуклеиновой кислоты будет равно нескольким тысячам копий на реакцию.

В мире, и в Украине в частности, с начала эпидемии COVID-19 ведутся дискуссии относительно того, насколько надежной является такая методика. Одни источники говорят, что ошибочным может быть каждый четвертый тест, другие указывают, что количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов составляет лишь несколько процентов. Учитывая актуальность темы, рассмотрим на примере ПЦР для диагностики COVID-19 по каким причинам могут возникать сомнительные или ошибочные результаты. Большинство указанных аспектов имеет место и в случае с ПЦР-тестированием других инфекционных заболеваний человека.

Особенности выбора места для взятия биологического материала

Такие возбудители, как SARS-CoV-2, способны поражать значительное количество органов. Для исследования на COVID-19 обычно берутся мазки из горла или носоглотки, где возбудитель в большом количестве находится ограниченное время — на 5-10 день от начала инфицирования, далее он спускается ниже — к бронхам и легким. Поэтому отрицательный результат ПЦР-теста не может исключать факта инфицирования пациента COVID-19.

С одной стороны, риски получить ложноотрицательный результат ПЦР-теста несколько возрастают на 1-7 день от начала инфицирования, когда количество вируса мало, а также на 10-30 день, когда, во-первых, COVID-19 уже «ушел» ниже, и, во-вторых, в организме уже присутствуют в достаточном количестве антитела, и размножение вируса более или менее эффективно сдерживается иммунной системой. С другой стороны, в некоторых случаях, мы можем получить сомнительно положительный результат ПЦР-теста даже на 60-й день от начала инфицирования, когда человек уже переболел, но в ее биологическом материале все еще можно найти обломки вируса. Все вышесказанное касается только некоторых отдельных случаев и не имеет характера «абсолютной закономерности».

Алгоритм тестирования регламентирован на государственном уровне и, если существует обоснованное подозрение на инфицирование COVID-19, для уточнения диагноза могут проводить ПЦР-анализ повторно.

Неправильное взятие биологического материала

Во избежание ложноположительных результатов вследствие загрязнения — попадание молекул ДНК/РНК из внешней среды, — клинический материал необходимо отбирать стерильными одноразовыми инструментами в одноразовые стерильные пробирки согласно установленным стандартам МОЗ. Взятие материала должны проводить медицинские работники, одетые в средства индивидуальной защиты.

Недостаточное количество биологического материала может привести к ложноотрицательным результатам исследования. В некоторых случаях, эту проблему можно отследить на этапе выделения нуклеиновых кислот или в процессе амплификации (при условии использованием в диагностических наборах для обнаружения SARS-CoV-2 внутреннего контроля, то есть фрагмента генома человека).

Несоблюдение температуры и сроков хранения

Учитывая возможность распада РНК в клиническом материале, сроки хранения и транспортировки должны быть минимальными. В идеальном случае все мазки нужно транспортировать в лабораторию в течение 24-48 часов с момента взятия в специальном транспортной среде при температуре плюс 4 °C. Транспортная среда должна содержать специальные реагенты — муколитики, обеспечивающие разрушение слизи, которая подавляет ПЦР. Если отсутствует возможность своевременно доставить образцы материалов в лабораторию, их можно замораживать до минус 70 °C, используя для этого твердую углекислоту — «сухой лед». Образцы можно хранить в лаборатории в течение недели при температуре минус 20 °C, или до месяца при температуре минус 70 °C. Критическим моментом является количество замораживаний/размораживаний образца: чем их больше, тем ниже качество образца и, вследствие этого, и чувствительность метода в целом.

В результате нахождения образцов в транспортной среде больше срока, рекомендованного производителем, происходит рост естественной бактериальной микрофлоры, которая обычно находится в ротовой полости человека, и разрушение молекул вирусной РНК в образце. При использовании специальных консервантов и стабилизаторов, биоматериал может храниться в температурном диапазоне в соответствии с инструкцией производителя сроком до месяца.

Выделение нуклеиновых кислот

ПЦР-исследование не проводится непосредственно на биологических образцах и требует предварительной пробоподготовки. На этом этапе большое значение имеет качество наборов для экстракции нуклеиновых кислот, которые должны обеспечить выделение образца соответствующей концентрации и степени очистки от примесей, подавляющие ПЦР. Из-за неправильного выбора набора также может быть потеряна часть или даже все РНК возбудителя, что может приводить к ложноотрицательным результатам. Качество и чистоту нуклеиновых кислот можно проверить с помощью специального аналитического прибора — спектрофотометра. Он есть во многих лабораториях, осуществляющих ПЦР-исследования.

Выделенную из образцов РНК можно хранить при температуре минус 20 °C до недели. Для более длительного хранения нужна температура минус 70 °C. Также можно использовать специальные реагенты, стабилизирующие РНК и предупреждают ее деградации (например, DEPC — диэтилпирокарбонат).

Амплификация

Процесс амплификации (увеличение копий участков ДНК, которые обычно содержат необходимые фрагменты целевых генов) может включать до 45 циклов, во время каждого из них количество копий удваивается. Он обеспечивается реагентами, которые входят в диагностические наборы для выявления SARS-CoV-2, и приборами, обеспечивающими циклическую смену температур — амплификаторами.

Для обеспечения корректных результатов, качество диагностических наборов является первоочередным требованием. Также лаборатории должны проводить процедуру их верификации, проведя сравнительные испытания с собственными панелями референтных образцов и решениями от других производителей. Наборы должны поступать в лаборатории в термобоксах с холодовыми блоками и храниться при температуре минус 20 °C. Несоблюдение условий их транспортировки или хранения приводит к повреждению компонентов наборов, и, вследствие того, к ложноотрицательным результатам. Чтобы предупредить эту ошибку, в состав каждого диагностического набора входит положительный контрольный образец, задачей которого является установление работоспособности реагентов.

Диагностические наборы должны быть совместимыми с амплификаторами, используемыми в лаборатории. Реагенты, входящие в состав набора, меченные различными флуоресцентными красителями. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном диапазоне (на определенном «канале»). Если прибор имеет слабую чувствительность по определенным флуоресцентным каналам, это может приводить к ошибочным результатам. Во избежание ошибок работники лабораторий должны проверять исправность работы приборов, а также настройки параметров работы и протоколов амплификации.

Контаминация образцов

При несоблюдении мер безопасности в помещениях лаборатории могут накапливаться продукты амплификации. Это приводит к контаминации образцов, и, в общем итоге, к ложноположительным результатам. Для подтверждения отсутствия загрязнения, каждую серию ПЦР-исследований нужно сопровождать постановкой негативных контрольных образцов, включенных в состав диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Перекрестная контаминация может возникать из-за попадания аэрозольных частиц от соседнего образца, содержащего вирусную РНК, при внесении образцов в ПЦР-смесь. На этапе амплификации контаминированный образец издает слабый положительный результат, который означает, что в исследуемой пробе обнаружено очень малое количество вируса. Но такой результат также может указывать, что человека тестировали до наступления полного выздоровления и уровень вируса в его организме был низким.

Способы предупреждения контаминации — использование наконечников с фильтрами, химическая и ультрафиолетовая дезинфекция всех рабочих поверхностей, наличие отдельных наборов дозаторов, оборудования, халатов и перчаток для каждой зоны, проведения внутрилабораторного и внешнего контроля качества исследований — регламентированы на государственном уровне.

Другими эффективными, однако дорогостоящими мероприятиями для предотвращения контаминации является автоматизация этапов выделения нуклеиновых кислот и амплификации, а также двойной контроль — постановка каждого образца в двух параллельных реакциях.

Ошибки обработки данных

Расчеты результатов ПЦР в реальном времени проводятся с использованием компьютерных программ. Амплификатор в автоматическом режиме измеряет интенсивность флуоресценции в образцах на каждом цикле. Кривая амплификации имеет так называемую фазу экспоненциального роста, после которой следует фаза плато. Автоматическая интерпретация результатов не всегда дает правильный результат, поэтому рекомендуется проводить анализ кривых амплификации на предмет пересечения пороговых значений, и корректировать задачи пороговых значений по мере необходимости. Для большей достоверности можно сравнить такую ​​сомнительную кривую с кривой подтвержденного положительного образца.

Подытожим

На каждом этапе исследования являются условия, несоблюдение которых может привести к недостоверным результатам. Некоторые из потенциальных ошибок являются общими для большинства видов лабораторной диагностики (например, ошибки при взятии и хранения образца, настройка оборудования), тогда как другие являются специфическими только для этого вида исследования (например, контаминация образцов, низкое качество выделенных нуклеиновых кислот).

ПЦР — многостадийный метод, и для получения максимально достоверных и воспроизводимых результатов необходимо надлежащее выполнение каждого этапа процесса в соответствии со стандартами МОЗ и инструкциями производителей. Вторым важным условием является качество всех реагентов и расходных материалов, используемых в ПЦР: систем для сбора биологических материалов, наборов для выделения нуклеиновых кислот, диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Возможны ли ошибки в ПЦР-диагностике? Ложноотрицательные и ложноположительные результаты ПЦР

На получение ложных результатов в ПЦР-диагностике — как ложноположительных, так и ложноотрицательных — могут повлиять различные обстоятельства.

Применение метода полимеразной цепной реакции — ПЦР — требует строжайшего соблюдения всех этапов анализа, начиная от забора анализа врачом до интерпретации полученных результатов анализа. Насколько информативен ПЦР-анализ зависит от многих обстоятельств.

• Ложноположительный результат анализа может получиться в результате попадания в материал (мазок или соскоб уретры) крови.
• Подобные же ложноположительные результаты ПЦР-анализа получаются вследствие не попадания в материал эпителиальных клеток, а содержания большого количества совершенно неинформативной слизи.
• На получение ложных результатов ДНК-анализа оказывает влияние неправильная транспортировка и хранение полученных проб. ДНК инфекции в этом случае может разрушаться и как следствие — ложноотрицательный результат.
• Нарушение стерильности при проведении ПЦР-диагностики — еще одна причина ложноположительной ПЦР. В забранный материал пациента могут попасть чужеродные бактерии с рук врача, с одежды, со стекла или загрязненных инструментов, многоразовой посуды. В результате обнаружится «несуществующая» инфекция.
• Непригодность реагентов. Неоснащенная и несовременная лаборатория, где на непригодность реагентов врачи «закрывают глаза» — это еще одна и серьезных причин недостоверной диагностики. Конечно, это сильно удешевляет лабораторную диагностику, но не может не сказаться на ее результатах.

Стремясь избежать подобных ошибок, врачи медицинского центра «Евромедпрестиж» очень серьезно подходят к проведению лабораторной диагностики: используют только одноразовые материалы на всех этапах анализа, соблюдают необходимые меры по поддержанию полной стерильности лаборатории и врачебного кабинета. У нас работают только врачи высшей категории и опытные лаборанты, которые регулярно повышают свою квалификацию, чтобы не лечить несуществующие болезни, а получать достоверные результаты.

читать далее
свернуть

АНАЛИЗЫ, КОТОРЫЕ МОЖНО СДАТЬ У НАС:

• Covid-19. Анализы на антитела к коронавирусу

• Анализы на инфекции

• Анализы Подготовка и расшифровка

  • Анализ кала

  • Анализ крови на RW

  • Анализ крови на сахар

  • Анализ крови на хламидиоз

  • Анализ мочи

  • Анализ мочи по Нечипоренко

  • Анализ мочи при беременности

  • Анализ на АФП

  • Анализ на ВИЧ

  • Анализ на гемоглобин

  • Анализ на гормон ЛГ

  • Анализ на гормоны

  • Анализ на дисбактериоз

  • Анализ на кортизол

  • Анализ на краснуху

  • Анализ на онкомаркеры

  • Анализ на остеопороз

  • Анализ на паразитов

  • Анализ на паракоклюш

  • Анализ на прогестерон

  • Анализ на пролактин

  • Анализ на РАРР-А

  • Анализ на РЭА

  • Анализ на Са-125

  • Анализ на Са-19-9

  • Анализ на совместимость

  • Анализ на тестостерон

  • Анализ на ТТГ

  • Анализ на ФСГ

  • Анализ на эстриол

  • Анализ соскоба на наличие яиц остриц

  • Анализ спермы (Спермограмма)

  • Анализы на грибок

  • Биохимический анализ крови

  • Гемостазиограмма, Коагулограмма

  • ДНК-диагностика

    • Достоинства и недостатки ПЦР-диагностики

    • Метод ПЦР в гинекологии

    • Ошибки в ПЦР-диагностике

    • ПЦР и ИФА-диагностика

    • Современная ДНК-диагностика

    • Строение ДНК

    • Этапы полимеразной цепной реакции (ПЦР)

  • Общий анализ крови (Клинический анализ крови)

  • Общий мазок

  • Определение беременности. Анализ крови на беременность

• Анализы при бесплодии

• Анализы при дисфункции яичников

• Анализы при кистах и опухолях яичников

• Анализы при нарушениях веса

• Анализы при подборе гормональной контрацепции

• Анализы при подготовке к беременности

• Молекулярно-генетические исследования

• Обследование молочных желез

• Обследование при гирсутизме и проблемах с волосами

• Обследование при задержке менструации

• Обследование при зуде гениталий

• Обследование при менопаузе

• Обследование при невынашивании беременности

• Обследование при эндометриозе

• Обследование щитовидной железы

• Обследования при определении овуляции

• Полное обследование организма

• Эрозия шейки матки

Остались вопросы? Мы перезвоним Вам в течении 10 минут

Наши цены

• Covid-19 метод ПЦР

  Наименование услуги	Цена, ₽
  ПЦР-тест на Covid-19, мазок (ПЦР-тест на коронавирус SARS-CoV-2)	1 990
  Экпресс тест ПЦР на Covid-19, мазок (Экспресс-тест, ПЦР, РНК вируса SARS-CoV-2)	3 890
  Забор биоматериала	390

• Covid-19 определение антител IgG

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Антитела количественные к спайковому (S) белку SARS-CoV-2, IgG (Anti-SARS-CoV-2, spike (S) protein, IgG, quantitative)	1 490
  Антитела качественные к спайковому (S) белку SARS-CoV-2, IgG;. (Аnti-SARS-CoV-2 S (spike) protein antibody, IgG, qualitative).  С целью оценить иммунный статус после COVID-19	1 090
  Антитела качественные поствакцинальные (ЭпиВакКорона, Вектор) к SARS-CoV-2 (N-, S-белки), SARS-CoV-2-IgG-Вектор, (Post-vaccination (EpiVacCorona Vector) SARS-CoV-2 (N-, S-proteins) antibodies, IgG, qualitative)	2 290
  Взятие крови из вены	390
  Для проведения исследования в клиниках Москвы необходимо предъявить СНИЛС и документ удостоверяющий личность

• Аллергологические исследования

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Панель аллергенов Пищевые №22 (Горбуша, кита, лещ, лосось, речной окунь, сом, скумбрия, навага)	1 490
  Панель аллергенов Пищевые №23 (Дорадо, икра красная, лангуст, осьминог, раки, речная форель, рыба сиг, устрицы)	1 490
  Панель аллергенов Пищевые № 2 (Арахис, Фундук, Морковь, Треска, Картофель, Кунжут, Миндаль, Краб, Грецкий орех, Сельдерей	3 100
  Панель аллергенов № 2 респираторная (RIDA-screen) , IgE (до 5р.д.)	5 490
  Респираторная скрининговая панель из смесей аллергенов	7 650
  Респираторная панель (Respiratory panel PROTIA Allerqy-Q). Мультиплексный диагностический набор для диагностики аллергии	8 740
  Аллерген к эпителиям кошки, IgE (Cat Dander-Epithelium, E1, IgE)	760
  Аллерген к перхоти кошки (e1), IgE, ImmunoCAP (Cat dander (e1), IgE)	890
  Аллерген к эпителиям собаки (Е2), аллерген-специфические IgG	760
  Аллерген к перхоти собаки (е5), IgE, ImmunoCAP (Dog dander (e5), IgE)	890
  Аллерген домашняя пыль, Greer (h1), IgE, ImmunoCAP (House dust allergen, Greer (h1), IgE). Используют с целью скрининга на наличие сенсибилизации к распространенным аллергенам домашней пыли.	1 050
  Аллерген домашняя пыль Hollister–Stier Lab. (h2), IgE, ImmunoCAP (House dust allergen Hollister –Stier Lab. (h2), IgE).  Используют для выявления сенсибилизации к аллергенам домашней пыли.	1 050
  Панель наиболее распространённых пищевых аллергенов для скринингового обследования с целью выявления значимых аллергенов при подозрении на пищевую аллергию. Результат выдаётся с указанием концентрации и класса IgE по каждому аллергену в отдельности.
  Взятие крови из вены	390

• Аутоимунные заболевания (антитела)

  Наименование услуги	Цена ,₽
  Антитела к кардиолипину (IgG, IgM, IgA) (сумм.) кол.	1 450
  Антитела к тиреопероксидазе (АТ- ТПО)	610
  Антитела к рецепторам (АТ- ТТГ)	1 790
  Антитела к антигенам миокарда	2 790
  Антинуклеарные антитела/ ANA-скрининг (антигены ds-DNA, гистоны, рибосомальный Р-протеин nRNP/Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, центромеры	1 110
  Антитела к односпиральной (денатурированной) ДНК (a-ssDNA)	990
  Антитела к двухспиральной (нативной) ДНК (a-dsDNA)	990
  Антитела к циклическому цитруллиновому пептиду (ССР)	1 590
  Антитела к В- 2 гликопротеину IgA/М/G (сумм.) кол.	1 100
  Антитела к цитоплазме нейтрофилов, NSCA класса IgG	960
  Антитела к цитоплазме нейтрофилов, NSCA класса IgА	1 050
  ANCA- профиль (протеиназа 3, МПО, эластаза, катепсин G, BP, лактоферин) IgG полуколич.	2 790
  Антитела к ХГЧ IgM	2 200
  Антитела к ХГЧ IgG	2 200
  Антитела к фосфатидилсерину IgG кол.	1 250
  Антитела к фосфатидилсерину IgМ кол.	1 250
  Антитела к фосфолипидам IgG кол.	1 250
  Антитела к фосфолипидам IgМ кол.	1 250
  Антиспермальные антитела	1 320
  Антиовариальные антитела	1 290
  Антитела IgA к тканевой трансглутаминазе	650
  Антитела IgG к тканевой трансглутаминазе	650
  Антитела IgA к глиадину	965
  Антитела IgG к глиадину	965
  Антитела к Saccharomyces cerevisiae (ASCA), IgA	1 630

• Бактериальные инфекции (кровь)

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Урогенитальные инфекции
  Хламидии трахоматис IgA	755
  Хламидии трахоматис IgG	755
  Хламидии трахоматис IgM	755
  Микоплазма хоминис IgG	555
  Микоплазма хоминис IgА	555
  Микоплазма хоминис IgМ	960
  Кандидоз  IgG	910
  Уреаплазма IgG	555
  Уреаплазма IgА	555
  Гарднереллез
  Трихомониаз
  Лактобациллы
  Другие бактериальные инфекции
  Хеликобактер пилори IgG	910
  Хеликобактер пилори IgA	910
  Сальмонелла (РПГА с диагностикумом, anti-Salmonella A,B,C1,C2,D,E )	770
  Антитела суммарные к туберкуллезу	960

• Бактериологические исследования (посев)

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Посев отделяемого половых органов на микрофлору, определение чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам	1 560
  Посев на микрофлору из ЛОР органов с определением чувствительности к антибиотикам, бактериофагам и антимикотикам	1 490
  Посев мокроты на микрофлору с определением чувствительности к антибиотикам	2 200
  Посев мочи с определением чувствительности к антибиотику	1 380
  Посев секрета простаты с определением чувствительности к антибиотику	1 380
  Посев спермы с определением чувствительности к антибиотику	1 380
  Посев на Mycoplasma hominis с чувствительностью к антибиотику	1 110
  Посев на Ureaplasma urealyticum с чувствительностью к антибиотику	1 110
  Посев на дифтерию	860
  Посев на дрожжеподобные грибы (Candida) с определением чувствительности к антибиотику	850
  Посев на листерии с определением чувствительности к антибиотикам	1 210
  Посев на трихомонаду с чувствительностью к антибиотику	1 500
  Посев на гонорею с чувствительностью к антибиотику	1 500
  Взятие мазка/соскоба	390

• Биохимические исследования крови

  Наименование услуги	Цена,₽
  Аланиновая трансаминаза (АЛТ)	290
  Аспарагиновая трансаминаза (АСТ)	290
  Альфа амилаза	290
  Амилаза панкреатическая	410
  Альбумин	350
  Аполипопротеин А1	630
  Аполипопротеин В	630
  Антистрептолизин –О (АСЛ-О)	550
  Ангеотензинпревращающий фермент (АПФ)	2 590
  Антитела к инсулину	975
  Антитела к бета- клеткам поджелудочной железы	1 330
  Антитела к глутаматдекарбоксилазе (АТ к GAD)	1 330
  Гамма-ГТ (ГГТ)	290
  Глюкозотолерантный тест	1 130
  Билирубин общий	290
  Билирубин прямой	290
  Билирубин непрямой	410
  Белковые фракции	690
  Витамин В-12	925
  Витамин В-12 активный  (холотранскобаламин)	2 050
  Глюкоза	290
  Гликированный гемоглобин	750
  Гомоцистеин	1 800
  Д (ИФА)	1 590
  Индекс атерогенности	350
  Железо	300
  КФК (креатинфосфокиназа)	410
  Кислая фосфатаза	290
  ЛДГ (лактатдегидрогеназа)	290
  Латентная железосвязывающая способность сыворотки	330
  Лактат	730
  Липаза	455
  Липопротеин (а)	970
  ЛПВП	290
  ЛПНП	290
  ЛПОНП	330
  Миоглобин	1 090
  Креатинин	290
  Креатининкиназа МВ (КФК- МВ)	520
  Кальций общий	285
  Кальций ионизированный	480
  Калий/Натрий/Хлор	420
  Калий	290
  Магний	340
  Мочевина	290
  Мочевая кислота	290
  Медь	410
  Натрий	290
  Общий белок	290
  ОЖСС	300
  Риск атеросклероза (скрининг)- триглицериды, холестирин общий, ЛПВП, ЛПНП, коэффициент атерогенности	880
  Ревматоидный фактор	550
  Уровень сахара в крови	280
  Определение уровня сахара в крови (с нагрузкой)	1 130
  Трансферрин	650
  Тропонин I	1 190
  Триглицериды	290
  Ферритин	685
  Фруктозамин	800
  Фосфор	300
  Фолиевая кислота	999
  Хлор	290
  Холестерин общий	290
  Холинэстераза	350
  Цинк	300
  Церулоплазмин	640
  Щелочная фосфатаза	290
  С- реактивный белок	550
  С- реактивный белок ультрачувствительный	610
  Эозинофильный катионный белок (ЕСП)	910
  Эритропоэтин	1 350
  в- Cross laps	1235

• Вирусные инфекции крови

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Краснуха IgG	930
  Краснуха IgM	930
  Авидность антител к вирусу краснухи	1 050
  Корь IgG	865
  Коклюш (IgM)	970
  Коклюш (IgA)	970
  Коклюш (Anti-B pertussis IgG)	970
  Вирусный паротит	765
  Аденовирус IgG	1050
  Аденовирус IgA	1 050
  Респираторно-синцитиальный вирус  IgG	950
  Паракоклюш	520
  Токсокар IgG кач	560
  Тканевая трансглутаминаза IgA	720
  Тканевая трансглутаминаза IgG	720

• Гемостазиология (кровь)

  Наименование услуги	Цена, ₽
  АЧТВ (Активированное частичное тромбопластиновое время)	350
  Антитромбин III	490
  Анализ крови на свертываемость	430
  Анализ крови на свертываемость+ длит.кровотечения	790
  Волчаночный антикоагулянт	990
  Инсулино- резистентность	1 020
  Коагулограмма (гемостазиограмма)	1 350
  Коагулограмма: ААЧТВ; Протромб. время + МНО; Тромб. время; Фибриноген; Антитромбин III; фибринолитическая активность (комплекс)	1 600
  Протромбиновый индекс,протромбин по Квику + МНО	390
  Протромбиновое время	390
  Протеин S	1 560
  Протеин C	1 560
  Фибриноген	405
  РКФМ	320
  D- димер	1 390

• Генетические исследования крови

  Наименование услуги	Стоимость, ₽
  Генетический риск атеросклероза и ИБС, предрасположенность к дислипидемии	7 500
  Развернутое генетическое обследование для женщин	12 900
  Фармакогенетика Варфарин	3 200
  Синдром Жильбера	3 300
  Синдром Жильбера  расширенный	3 700
  Генетика метаболизма Лактозы	1 550
  Prenetix- не инвазивная пренатальная диагностика	28 000
  Риск развития сахарного диабета 1 типа	12 700
  Риск развития сахарного диабета 2 типа (определение вариантов в генах TCF7L2,PPARG, ADIPOQ.)	7 900
  Кардиогенетика Гипертония	4 850
  Кардиогенетика Тромбофилия	3 630
  Генетика метаболизма Фолатов	3 200
  Мужское бесплодие: Определение генетических причин азооспермии	2 500
  Женское бесплодие	20 700
  Беременность(комплекс) — риск невынашивания	3 700
  Преэклампсия. Оценка риска	5 800
  HLA генотипирование 2 класса для пары ( цена за 1 человека)	4 700
  Аналитическое заключение врача- генетика по одному профилю	2 500
  Комплекс «Акне»	28 050
  Кариотип (1 пациент)	5 000
  Кариотипирование с выявлением аберраций	5 400
  Кариотип супружеской пары	9 200
  Кариотипирование с выявлением аберраций с фото хромосом	6 500
  Кариотип с фото хромосом (1 пациент)	6 500
  Кариотип супружеской пары с фото хромосом	9 000
  Кариотип  с выявлением аббераций  хромосом (супружеской пары)- с фотографией	11 000

• Гормональные исследования крови

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Фертильность и репродукция
  Антитела к овариальным (текальным) антигенам	1 520
  Антимюллеров гормон (АМГ)	1 580
  17- ОН прогестерон	760
  Бета — ХГЧ	890
  Глобулин, связывающий половые гормоны ГСПГ	980
  Дигидротестостерон	1 590
  Ингибин- А	3 300
  Ингибин- В	1 690
  Лютеинизирующий гормон (ЛГ)	595
  Макропролактин (при концентрации пролактина более 700 мЕд/л)	1 230
  Прогестерон	595
  Пролактин	595
  Свободный тестостерон	1 290
  Тестостерон	595
  Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)	595
  Экстрадиол	595
  Экстрадиол свободный	980
  Гормоны надпочечников
  Анренокортикотропный гормон (АКТГ)	930
  Альдостерон	1 050
  Андростендион	1 420
  ДГЭАС (Дегидроэпиандростерон сульфат)	1 420
  Кортизол	595
  Адреналин
  Норадреналин
  Гормоны щитовидной железы
  Т4 общий	595
  Т4 свободный	595
  Т3 общий	595
  Т3 свободный	595
  Тиреотропный гормон (ТТГ)	595
  ТГ (тиреоглобулин)	870
  Тиреоглобулин (ТГ)	950
  Другие гормоны
  Циклический цитруллиновый пептид (АЦЦП, А-CCР) — ревматоидный артрит	1 430
  Глюкозотолерантный тест. Инсулин (ГТТ) (диагностика сахарного диабета)	650
  Лептин	1 150
  Р1NP (маркер формирования костного матрикса)	1 380
  Остеокальцин (неколлагеновый белок костного матрикса)	1 210
  Ренин + ангиотензин I	1 090
  Ренин (маркер гипокалиемии и гипертонии)	1 390
  С- пептид (маркер углеводного обмена)	650
  Соматотропный гормон (СТГ)	1 590
  Соматомедин С	1 350

• Забор материала

  Наименование услуги	Стоимость
  Забор биологического материала	390 ₽
  Забор биологического материала: кровь из вены	390 ₽
  Забор биологического материала: кровь из пальца	390 ₽
  Забор биологического материала: мазок	390 ₽
  Забор биологического материала: секрет простаты	390 ₽

• Иммунные исследования

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Исследования основных параметров клеточного иммунитета: подсчет лейкоцитов, лимфоцитов, нетрофилов, CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD56, CD4/CD8, CD19	3 800
  Расширенное иммунологическое исследование клеточного иммунитета: подсчет лейкоцитов, лимфоцитов, нейрофилов, CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD38, CD54, CD71, CD95, CD56, CD4/CD8, CD19, CD95	5 900
  Иммуноглобулины A, M, G	850
  Иммуноглобулины A (IgA)	380
  Иммуноглобулины М (IgM)	380
  Иммуноглобулины G (IgG)	380
  Иммуноглобулины E (IgE)	780
  С3 компонент комплемента	870
  С4 компонент комплемента	870
  Общие циркулирующие имунные комплексы (ЦИК)	1 010
  НСТ- тест, латекс- тест (фагоцитоз)	610

• Иммуногематология (групповая принадлежность крови)

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Группа крови, резус-фактор	850
  Антитела к резус-фактору (титр)	1 280
  Антигены системы Kell (определение группы крови по наличию белка К)	1 090
  Фенотипирование эритроцитов по антигенам С, с, E, e, Cw , K, k	1 610

• Интерфероновый статус

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Интерфероновый статус без определения чувствительности лейкоцитов к препаратам	3 400
  Роферон	630
  Амиксин	630
  Неовир	630
  Циклоферон	630
  Галавит	630
  Гепон	630
  Иммуномакс	630
  Ликопид	630
  Полиоксидоний	630
  Ридостин	630
  Кагоцел	630
  Имунофан	630
  Арбидол	630
  Глутоксим	630
  Тактивин	630
  Тимоген	630
  Иммунал	630
  Имунорикс	630

• Исследование кала

  Наименование услуги	Стоимость, ₽
  Анализ кала общий (копрограмма)	620
  Анализ кала на определение панкреатической эластазы	2 350
  Анализ кала биохимический на дисбактериоз	1 910
  Исследования микробиома человека толстой кишки (просветная кишка) методом ГХ – МС (по Осипову)	4 700
  Анализ кала на простейшие и яйца гельминтов	440
  Анализ кала на простейшие и яйца гельминтов ПАРАСЕП	920
  Кальпротектин в кале	2 900
  Анализ на энтеробиоз	430
  Анализ кала на скрытую кровь	440
  Токсины А и В Clostridium difficile	1 100
  Ar Helic.pylori в кале	850
  Исследования микробиома человека толстой кишки (просветная микробиота) ГХ — МС (по Осипову )	4 700

• Исследования мочи

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Биохимия мочи
  Амилаза (суточная моча)	310
  Альбумин (микроальбуминурия)	450
  Белок общий	320
  Глюкоза (суточная моча)	330
  Креатинин	270
  Микроальбумин (разовая моча)	500
  Микроальбумин	760
  Мочевая кислота	330
  Мочевина	330
  Органические кислоты в моче	5 700
  Гормоны в суточной моче
  17-кетостероиды (17-КС)	1 800
  Кортизол (суточная моча)	1 120
  Свободный кортизол (моча)	1 990
  Тест на беременность по моче	240
  Катехоламины мочи
  Адреналин	650
  Метанефрины (суточная моча)	3 350
  Норметанефрины (суточная моча)	1 700
  Норадреналин	650
  Катехоламины: адреналин, норадреналин, дофамин (суточная моча)	1 850
  Метаболиты катехоламинов и серотонина (ГВК, ВМК, 5-ОИУК )	1 800
  Промежуточные метаболиты катехоламинов (метанефрин и норметанефрин )	2 100
  Нейромедиаторы в суточной моче
  5-оксииндолуксусная кислота (моча)	1 200
  Ванилилминдальная кислота (моча)	1 200
  Гистамин (моча)	1 200
  Дофамин (моча)	650
  Серотонин (моча)	1 200
  Клинические исследования мочи
  Общий анализ мочи — срок изготовления 1 день	410
  Общий анализ мочи — (срочно) в день обращения	490
  2-х стаканная проба мочи	630
  Анализ мочи по Нечипоренко — срок изготовления 1 день	450
  Анализ мочи по Нечипоренко — (срочно) в день обращения	550
  Патологические маркеры мочи
  UBC (специфический антиген рака мочевого пузыря) (моча)	1 400
  Альфа-амилаза панкреатическая (моча)	330
  ДПИД (дезоксипиридинолин) (моча)	1 570
  Тест на протеинурию (альбумин/креатинин) в разовой порции мочи	450
  Микроэлементы в моче
  13 микроэлементов в моче (Se; Zn; Co; Mn; Mg; Cu; Fe; Ca; Hg; As; Pb; Cd; Al)	4 500
  6 микроэлементов в моче ( Hg; Cd; As; Li; Pb; Al)	2 500
  Аминокислоты (32) в моче	6 590
  Калий/Натрий/Хлор	350
  Кальций	230
  Магний	330
  Фосфор	330

• Клинические исследования крови

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Общий анализ крови без лейкоцитарной формулы (капилярная кровь)	400
  Общий анализ крови буз лейкоцитарной формулы (венозная кровь)	400
  Клинический анализ крови 3 (гемоглобин, лейкоциты, СОЭ)	730
  Клинический анализ крови (развёрнутый)	730
  Клинический анализ крови (развёрнутый+ тромбоциты)	730

• Общеклиническое исследование отделяемого

  Наименование услуги	Цена, ₽
  Посткоитальный тест	640
  Мазок на флору	600
  Мазок из носа на эозинофилы	400
  Общеклиническое исследование назального секрета (риноцитограмма)	850
  Соскоб шейки матки и/или цервикального канала по Лейшману-1препарат	670
  Исследование пунктатов молочной железы и кожи	670
  Исследование отделяемого молочной железы	670
  Исследование пунктатов щитовидной железы	670
  Анализ спермограммы с исследованием антиспермальных антител IgA\ IgG ( MAR — тест)	3 920
  Жидкостная цитология	2 200
  Определение онкомаркера в жидкостной цитологии	5 100
  Биопсия исследование 1 фрагмента (гисталогия)	3 870
  Соскоб с кожи на грибы	750
  Соскоб с ногтевых пластинок на грибы	750
  Соскоб на демодекс	750
  Соскоб с кожи на чесоточного клеща	750
  Соскоб на трепонему	750
  Анализ спермограммы	1 990
  Общеклиническое исследование сока предстательной железы	600

• Онкомаркеры

  Наименование услуги	Цена, ₽
  АФП (Альфа-фетопротеин). Оценка патологии плода при беременности, гепатоцеллюлярного рака печени, опухолей яичек или яичников	1 600
  Антитела к митохондриям (Антимитохондриальные IgG, маркер первичного билиарного цирроза печени)	1 430
  Гастрин-17 (диагностика атрофическиого гастрита, маркер рака и язвенной болезни желудка)	1 870
  Индекс ROMA — оценка риска рака яичников у женщин (CA-125 и HE 4)	2 560
  Исследование полеморфизов в гене ТР53 (рак молочной железы)	4 500
  Инсулин (маркер гормоносекретирующей опухоли бета-клеток поджелудочной железы)	650
  Проинсулин	1 280
  Кальцитонин (диагностика остеопороза, маркер опухоли щитовидной железы)	990
  ПСА (простатический специфический антиген) общий	690
  ПСА общий/свободный (простатический специфический антиген общий, маркер рака предстательной железы)	1 390
  Оценка здоровья простаты (включает три маркера: ПСА общего, ПСА свободного и про-ПСА)	3 600
  РЭА (раковоэмбриональный антиген)	700
  Рак молочной железы	4 300
  Рак молочной железы и яичников (расширенный комплекс)	21 990
  CA 15­3 (маркер рака молочной железы)	1 030
  CA-125 (маркёр рака яичников)	1 010
  CA 19­-9 (маркёр рака кишечника, желудка, поджелудочной железы, желчного пузыря)	1 020
  CA-242 (маркёр рака поджелудочной железы, толстого кишечника, прямой кишки, колоректального рака)	2 100
  Cyfra-21-1 (маркер немелкоклеточного рака легких)	1 530
  HE-4 (маркёр для комплексной диагностики эпителиального рака яичников)	1 480
  SCC (Антиген плоскоклеточного рака)	1 400
  Тиреоглобулин (маркер щитовидной железы)
  Паратиреоидный гормон (ПТГ) (маркер гиперпаратиреоза)	930

• ПЦР диагностика. ПЦР NASBA (соскоб)

  Наименование услуги	Цена, ₽
  ПЦР 10	2 950
  ДНК Listeria monocytogenes (ПЦР)	850
  ДНК Listeria monocytogenes (кровь)	450
  Бакретиальный вагиноз колич.	650
  Вирус простого герпеса 6 типа (HHV), количественно ДНК	400
  ВРИ микоплазма / хламидии кач.	550
  ВПЧ	от 420
  Вирус Варицелла-Зостер	420
  Гонорея кач.	420
  Гарднерелла кач. ДНК	420
  Гарднерелла колич. ДНК	610
  Герпес 1/2 (HSV)- кач. ДНК	420
  Кандидоз кач. ДНК	420
  Микоплазма genitalium- кол. ДНК	650
  Микоплазма hominis – кол.ДНК	650
  Микоплазма hominis- кач. ДНК	420
  Микоплазма genitalium- кач. ДНК	420
  Стрептококк группы В	1 280
  Стрептококк группы А кач.	900
  Соскоб с гортани на Mycoplasma / Chlamidia (pneumoniac)	610
  Трихомонада	420
  Уреаплазма кач. ДНК	420
  Уреаплазма колич.	650
  Хламидия кач. ДНК	420
  Хламидия кол.	650
  Флороценоз микоплазмы	740
  Флороценоз	1 690
  Флороценоз и Микроскопия	1 880
  Флороценоз и NCMT	1 980
  Флороценоз и NCMT и Микроскопия	2 610
  Цитомегаловирус кач.	420
  ЦМВ / ВЭБ /ВПГ 6 типа кач.	850
  Цитомегаловирус, количественно, ДНК	300
  Эпштейна-Барр, количественно, ДНК	350
  ПЦР NASBA. Ранняя диагностика ЗППП (соскоб)	900
  ANCA – цитоплазма IgG полуколичественный	1 760
  NASBA chlamidia trachomatis	2 370
  NASBA neisseria gonorrhoeae	2 370
  NASBA trichomonas vaginalis	2 370

• Ранняя диагностика заболеваний ЭЛИ-ТЕСТ

  Наименование услуги	Стоимость
  «ЭЛИ-Висцеро-Тест-24» (ранняя диагностика, полная панель) нервной системы, миокарда, печени, почек, надпочечников  лёгких, стенок желудка, кишечника, щитовидной железы, поджелудочной железы, простаты, тромбоцитов, эндотелия сосудов, а также к антигенам, характеризующие состояние иммунной системы.	6 950 ₽
  «ЭЛИ-В-Тест -6» (общее состояние иммунной системы при подготовке к вакцинации)	2 000 ₽
  «ЭЛИ-Диа-Тест-8» (состояние поджелудочной железы, сахарный диабет; общая терапия и эндокринология; уточняющий диагноз и оценка эффективности лечения)	2 100 ₽
  «ЭЛИ-ЖКТ- Тест -12» (состояние органов системы пищеварения;  гастроэнтерология; общая терапия; гепатология; эндокринология; уточняющий диагноз и оценка эффективности лечения)	2 600 ₽
  «ЭЛИ-П-Комплекс-12» (репродуктивное здоровье женщины)	2 840 ₽
  «ЭЛИ- Тест-12» (мужское здоровье )	2 640 ₽
  «ЭЛИ-АФС-ХГЧ Тест» (антифосфолипидный синдром, анти-ХГЧ синдром, состояние иммунной системы; акушерство и общая терапия; уточняющий диагноз и оценка эффективности лечения)	1 850 ₽
  Цитотест. Индивидуальный цитотоксический тест на переносимость 21 химического реагента (консерванты, красители, загустители, ароматизаторы)	5 000 ₽
  «ЭЛИ-АНКОР-Тест -12» (состояние сердечнососудистой системы)- предназначен для клинического использования в общей терапии, кардиологии и флебологии для оценки выраженности патологических процессов,нарушающих нормальное функционирование сердечно-сосудистой системы.	2 600 ₽
  «ЭЛИ-Н-Тест-12» (состояние нервной системы)	2 600 ₽

• Серологическая диагностика (антитела)

  Наименование  услуги	Цена, ₽
  ВИЧ
  Антитела к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типов (ВИЧ)	600
  ВИЧ –ДНК (ПЦР), качественное определение	3 630
  ВИЧ –определение РНК вируса , кол.	12 150
  Гепатит А (HAV):
  anti- HAV IgG, ИФА, кач.	720
  anti- HAV IgМ, ИФА, кач.	900
  Гепатит B (HBV):
  ДНК HBV, кровь, кач. ПЦР	360
  HbsAg, ИФА, кач.	600
  анти- HВsAg,  кол.	1 300
  anti- HBc ИФА cуммар., кач.	520
  anti- HBc  IgM, ИФА, кач.	850
  HBeAg, ИФА, кач.	720
  Гепатит C (HCV):
  РНК HCV, кровь, генотипирование (1a, 1b, 2a, 2b, 3a) ПЦР	1 300
  anti- HСV IgМ, ИФА, кач.	600
  anti- HСV суммарные, ИФА, кач.	400
  РНК HСV , кач.	755
  РНК HСV , кол.	9 190
  Гепатит D (HDV):
  anti- HDV  IgМ, ИФА, кач.	750 ₽
  anti- HDV, ИФА,  сумм., кач.	750 ₽
  Антимитохондриальные  антитела (АМА)	1 450 ₽
  Антитела к микросомальной фракции печени и почек (LKM)	1 100 ₽
  Гепатит Е
  Антитела к вирусу гепатита Е (IgG)	845
  Антитела к вирусу гепатита Е (Ig М)	845
  Сифилис
  RW РПГА	520
  Антитела к Treponeme pallidum методом РИФ в сыворотке крови	2 910
  Антитела к Treponeme pallidum РИБТ	3 960
  Антитела IgG к Treponeme pallidum методом иммуноблокинга (WB) в сыворотке крови	4 100
  Антитела IgM к Treponeme pallidum методом иммуноблокинга (WB) в сыворотке крови	4 100
  Антитела к Treponeme pallidum в реакции миккропреципитации с кардиолипиновым антигеном  (RPR/РМТ) в сыворотке крови	900
  Антитела к Treponeme pallidum (IgM)	810
  Антитела к Treponeme pallidum (IgG)	810
  Герпесвирусы
  Антитела IgM к цитомегаловирусу	840
  Антитела IgG к цитомегаловирусу	840
  Авидность антител IgG к цитомегаловирусу	1 155
  Антитела IgG к раннему антигену вируса Эпштейна-Барр	755
  ВЭБ IgG (к ядерному антигену)	1 050
  ВЭБ количественный, определение ДНК	550
  ВЭБ IgG (к капсидному белку)	840
  ВЭБ IgМ (к капсидному белку)	840
  ВЭБ IgG (к раннему белку)	970
  Варицелла-Зостер (Anti- VZV IgG)	880
  Варицелла-Зостер (Anti- VZV IgM)	765
  Антитела к вирусу простого герпеса 1 и 2 типа (HSV) кач.определение ДНК	465
  Антитела IgG к вируса простого герпеса 1 и 2 типа (кол.)	790
  Антитела IgМ к вируса простого герпеса 1и 2 типа	790
  Антитела IgМ к вируса простого герпеса 1 типа (кол.)	490
  Авидность АТ IgG к герпесу 1, 2 типа	1 330
  Антитела к вирусу герпеса 6 типа IgM	1 170
  ВПГ 1 и 2 тип (кол) IgG	960
  ВПГ 1 и 2 тип (кол) IgM	790
  Моликуты
  Микоплазма пневмонии IgG	600
  Микоплазма пневмонии IgA	840
  Микоплазма пневмонии IgM	600
  Микоплазма хоминис IgA	840
  Микоплазма хоминис IgM	840
  Микоплазма хоминис IgG	840
  Хламидии
  Хламидии пневмонии IgA	760
  Хламидии пневмонии IgM	760
  Хламидии пневмонии IgG	760
  Другие вирусные инфекции
  Вирус Зика (ПЦР (эякулят)	1 500
  Вирус Зика (ПЦР (ЭДТА+ слюна+ моча)	4 200
  Антитела к бета- клеткам поджелудочной железы	1 330
  Антитела к глутаматдекарбоксилазе (АТ к GAD)	1 450

Индивидуальный подход к лечению каждого пациента

Использование инновационного оборудования и аппаратуры

Лечение эректильной дисфункции (импотенции) ударно-волновым методом

Полный спектр лабораторной и функциональной диагностики

О клинике «евромедпрестиж»

Специально для сохранения и восстановления здоровья людей в 2000 году была основана
многопрофильная клиника «ЕВРОМЕДПРЕСТИЖ», в которой работают лучшие специалисты из 25 областей
медицины. Наши врачи, в совершенстве владеющие своим ремеслом, готовы бороться с любым Вашим недугом!

Мы заботимся о вашем здоровье с вниманием и любовью и поэтому нас рекомендуют друзьям

Тертичная Светлана Петровна, Главный врач клиники «Евромедпрестиж»

Благодарим Вас
за доверие!

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам

KostiukS.A.

Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Laboratory errors and risk management in the molecular genetic laboratory

Резюме. Тема лабораторных ошибок при проведении молекулярно-генетических исследований, в том числе методом ПЦР в режиме реального времени, очень сложна и не изучена специалистами лабораторной диагностики в виде отдельного направления в системе менеджмента качества. Она не обсуждается в практических кругах, не освещается в специальной медицинской литературе, научных публикациях. Разрозненные знания, отсутствие навыков аналитического анализа и участия в решении научных задач не позволяют специалистам молекулярно-генетических лабораторий практического здравоохранения эффективно организовать работу по выявлению лабораторных ошибок, которые могут быть на любом из этапов, носить методический или аналитический характер. Разработать единую типовую модель борьбы с лабораторными ошибками при проведении ПЦР-исследований сложно, поскольку каждая лаборатория может отличаться по организационной структуре, видам оборудования, используемым реагентам, перечню исследований. В этой связи необходимо на основе научного анализа возможных лабораторных ошибок сформировать профессиональное мышление у врачей лабораторной диагностики, работающих в практическом здравоохранении.

Ключевые слова: полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, преаналитический, аналитический и постаналитический этапы, методические и аналитические лабораторные ошибки.

Медицинские новости. – 2021. – №1. – С.6–10.

Summary. The topic of laboratory errors in molecular genetic researches, including real-time PCR, is very complex and has not been studied by laboratory diagnostics specialists as a separate area in the quality management system: it is not discussed in practical circles, it is not covered in special medical literature or scientific publications. Scattered knowledge, lack of analytical analysis skills and lack of participation in solving scientific problems do not allow the specialists of practical health care molecular genetic laboratories to effectively organize the work to identify laboratory errors, which can be at any stage, of a methodical or analytical nature. It is difficult to develop a single standard model for fighting laboratory errors during PCR studies, since each laboratory may differ in organization structure, types of equipment, reagents and the list of studies. In this regard, it is necessary, on the basis of a scientific analysis of possible laboratory errors, to form professional thinking among laboratory diagnostics doctors working in practical health care.

Keywords: real-time PCR, preanalytical, analytical and postanalytical stage, methodological and analytical laboratory errors.

Meditsinskie novosti. – 2021. – N1. – P.6–10.

Лабораторные методы диагностики сложно унифицировать, поскольку каждый из них имеет свои технические и диагностические особенности. Это в полной мере относится и к молекулярно-биологическим методам лабораторной диагностики в практическом здравоохранении, которые включают в себя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с электрофоретической детекцией, с детекцией по конечной точке, в режиме реального времени [7, 8]. Современный уровень технического прогресса в лабораторной медицине способствует снижению количества лабораторных ошибок, и если при внедрении в клиническую практику первого молекулярно-биологического метода – ПЦР с электрофоретической детекцией – исследователи сталкивались с проблемой контаминации, то есть с ложноположительными результатами, в настоящее время наиболее востребованным в практическом здравоохранении является ПЦР в режиме реального времени, что позволило создать для этого метода репутацию очень надежного исследования [4, 6]. Однако в реальности данное убеждение не является верным по своей формулировке.

Многие врачи лабораторной диагностики считают, что правильное выполнение исследований не должно приводить к ошибкам, и потому соблюдение инструкций к диагностическим тест-системам – это порой единственное, чем руководствуется сотрудник клинико-диагностической лаборатории. Однако не все тест-системы могут быть одинаково устойчивы к контаминации, могут иметь разный предел обнаружения. В этой связи врач лабораторной диагностики должен знать слабые стороны используемой тест-системы и организовать свою работу так, чтобы свести к минимуму вероятность возникновения недостоверного результата. Важно также учитывать материально-техническую базу, количество производимых исследований, копийность биологического материала.

Причины и механизмы формирования лабораторным ошибок при проведении исследований методом ПЦР в режиме реального времени слишком сложны, чтобы их интуитивно понимать. Учитывая, что в практическом здравоохранении в ПЦР-лабораториях трудятся не научные сотрудники, а врачи, то им будет важно понимать, что происходит на их конкретном рабочем месте, и планировать свою работу над ошибками. В условиях рутинной ежедневной практики ошибка не воспринимается как научный феномен со своими причинами и механизмами формирования, это вопрос поиска виноватых. В этом случае, поскольку речь идет о качестве работы лаборатории, всю ответственность возлагают на сотрудников лаборатории [5].

Диагностические ошибки могут быть различные, это зависит как от природы исследуемого биологического материала, так и от технологических особенностей исследования. Например, при использовании в диагностической медицинской лаборатории методического подхода к анализу результатов на основе флуоресцентной детекции по конечной точке и ПЦР в режиме реального времени выявление нуклеиновых кислот одних и тех же микроорганизмов может сопровождаться разными результатами, обусловленными различным пределом обнаружения данных диагностических тест-систем.

Всегда ли использование диагностикумов с высоким пределом обнаружения является достаточным дополнительным «защитным» фактором от недостоверных результатов? Считаем, что нет, и число допускаемых ошибок в диагностической лаборатории можно уменьшить только путем повышения профессионализма сотрудников. Неподготовленному специалисту трудно разобраться в преимуществах и недостатках различных технологий, определиться с их выбором, оценить правильность и рациональность организации технологического процесса, а также поддержать его на приемлемом уровне. Проблема образования становится более очевидной в связи с тем, что сотрудники, пройдя краткосрочное обучение на курсах повышения квалификации (1 месяц), проводят исследования не только по детекции нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, но и занимаются медицинской генетикой. Также одним из популярных направлений в молекулярной лабораторной диагностике стало создание «домашних» тест-систем – inhouse тест-систем, которые в лабораториях самостоятельно разрабатываются и валидируются, а для этого, безусловно, важна квалификация специалиста [7].

Ошибками можно считать:

1) оказание некачественной лабораторной услуги, сопровождающееся возникновение ложного результата, которые могут быть ложноположительными и ложноотрицательными;

2) оказание некачественной диагностической услуги, например, в случае использования метода ПЦР при верификации диагноза, когда он не является диагностически обоснованным методом исследования.

Опыт появления ПЦР в 2000-х годах в Республике Беларусь сопровождался ложноположительными результатами, что было существенным ограничением широкого распространения этого метода в клинической лабораторной диагностике. В настоящее время после 20 лет применения ПЦР-исследований ситуация изменилась: для установления многих заболеваний, уточнения фазы течения заболевания, оценки эффективности лечения, клинической и микробиологической излеченности ПЦР является важным диагностическим инструментом [4, 7, 8]. Однако данную ситуацию не следует рассматривать как проявление наступившей безупречности молекулярно-биологических методов исследования.

Понятие «ложноположительный» результат определяется понятием «диагностическая специфичность», которая рассчитывается по формуле [1, 5]:

Диагностическая специфичность

(ДС)= 

где ИО – истинно отрицательный результат теста, ЛП – ложноположительный результат теста.

Эта формула характеризует вероятность отрицательного результата при отсутствии болезни. При 100% специфичности тест не относит здоровых людей к категории больных и ложноположительные результаты отсутствуют.

Однако «специфичность» не является однозначной лабораторной характеристикой, поскольку в зависимости от причин ложноположительных результатов принято разделять аналитическую и диагностическую специфичность, что особенно важно для ПЦР-исследований [2, 3]. Под 100% аналитической специ-фичностью понимают отсутствие амплификации нуклеиновых кислот других микроорганизмов и человека, способность детектировать специфический флуоресцентный сигнал выше порогового значения в положительных образцах и отсутствие его в отрицательных образцах, то есть неспособность тест-системы выявлять исследуемый фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекционного заболевания, у здорового человека [3, 5, 7]. Аналитическая специфичность может меняться при применении различных олигонуклеотидных последовательностей праймеров и молекулярных зондов, тогда как диагностическая специфичность обусловлена совокупностью причин, действующих в условиях лабораторной практики, среди которых наиболее важной является контаминация.

Аналитическая специфичность – обязательный параметр валидации тест-системы и должна составлять 100%, но методы ее определения не совершенны. Каким образом происходит выбор последовательности праймеров и молекулярных зондов при разработке новой тест-системы? Первый этап: выбор осуществляется in silico с использованием электронных баз данных для исключения перекрестных реакций с известными ДНК и РНК других микроорганизмов. Вторым этапом выбранные последовательности проходят тестирование in vitro с использованием узкого числа возбудителей инфекционных заболеваний, что, однако, не может полностью исключить перекрестные реакции и, соответственно, ложноположительные результаты. Безусловно, это явление не распространенное и зависит от вида исследуемого биологического материала. В литературе можно встретить информацию о перекрестных реакциях при выявлении ДНК Neisseria gonorrhoeae, так как для вируса гепатита С таких публикаций нет [1, 13]. Это можно объяснить присутствием в исследуемом биологическом материале из урогенитального тракта комменсальных диплококков рода Neisseria spp., обменивающихся генетическими элементами с Neisseria gonorrhoeae, и появлением таким образом популяций Neisseria spp., обладающих генетической гомологией, критичной для использования данной тест-системы. Такая ситуация исключена для РНК вируса гепатита С. Ряд авторов объясняет снижение аналитической специфичности, обусловленное биовариацией микроорганизма [11], поэтому некоторые коммерческие тест-системы с течением времени при длительном их использовании могут терять свою аналитической специфичность.

Диагностическая специфичность обратно пропорционально отражает частоту ложноположительных результатов при реальном использовании тест-системы. Диагностическая специ-фичность зависит от аналитической специфичности. Однако существуют другие причины ее снижения. Одной из возможных причин ложноположительных результатов в ряде случаев может быть использование интеркалирующих красителей, особенность которых заключается в их способности без дифференциации связываться с любой ДНК. При этом накопление неспеци-фических продуктов амплификации может повлечь за собой заблуждение об истинном результате исследования в данном биологическом материале. При образовании димеров праймеров могут синтезироваться короткие ампликоны, при этом регистрация накопления продуктов амплификации возникает даже без участия целевой специфической нуклеиновой кислоты. В этом случае типичная положительная S-образная флуоресцентная кривая формируется только на поздних циклах амплификации (после 30-го цикла), поэтому следует исключить регистрацию и использование диагностических тест-систем для ПЦР в режиме реального времени на основе интеркалирующих красителей.

Наиболее часто причиной появления ложноположительных результатов выступает контаминация [9]. Возможная контаминация не является оцениваемым техническим параметром при клинических испытаниях и регистрации тест-системы, поскольку это показатель, по которому следует оценивать качество работы сотрудников лаборатории. В то же время устойчивость к контаминации диагностической тест-системы является важным техническим показателем, который следует определять при проведении межлабораторных испытаний или тестировании диагностикума в референтной лаборатории [10]. Частота ложноположительных результатов при проведении ПЦР-исследований зависит от «человеческого фактора» в выполнении технологического процесса в лаборатории, поэтому важно предусмотреть некоторые особенности использования тест-системы, которые позволят снизить влияние этого фактора и уменьшат вероятность получения ложноположительных результатов. По данным H. Zitzer, G. Heilek, K. Truchon и соавт. [15], возможно создать тест-системы, устойчивые к контаминации. Данные технологические особенности следует рассматривать как их бесспорное преимущество. В этой связи диагностическая специфичность может являться важным критерием для оценки качества тест-системы, и только более высокая себестоимость выполнения данных тестов является для многих лабораторий непреодолимым препятствием для их широкого практического применения.

Определение диагностической специ-фичности является сложным процессом, поскольку ложноположительные результаты могут регистрироваться не сразу, а по прошествии некоторого времени работы с данной тест-системой, поэтому диагностическая специфичность имеет очень неоднозначную оценку. Данный показатель должен определяться в ходе клинических испытаний в рамках государственной регистрации, в то же время методы ее оценки не совершенны.

Уровень возможной контаминации можно выражать в проценте постановок реакций амплификации, при которых выявлен хотя бы один положительный результат, или как доля ложноположительных результатов среди контрольных отрицательных образцов, или как доля ложноположительных результатов среди клинических биологических образцов, не содержащих специфическую нуклеиновую кислоту, которая является матрицей для амплификации [11, 15].

С практической точки зрения важно знать не только то, что тест-система эффективно детектирует конкретный микроорганизм с минимальным количеством ложноположительных результатов, что и определяется понятием «специфичность», но и иметь уверенность, что выявленный микроорганизм является этиологическим фактором заболевания в каждом конкретном клиническом случае при положительном результате теста. В качестве примера можно вспомнить условно-патогенные микроорганизмы, которые при концентрации выше диагностически значимой (пороговой), являются этиологической причиной воспалительного процесса. Специалисту клинического профиля необходимо иметь представление, насколько выявленный микроорганизм способен выступать в качестве этиологического фактора в данном конкретном клиническом случае при положительном результате теста. Для этого важно иметь высококопийный положительный результат (более 10³ копий/мл), в то время как низкокопийные образцы не имеют диагностической ценности. Для этого важно использовать лабораторный показатель – предсказательная ценность положительного результата.

Выявление ложноположительных результатов в практике является единственным способом визуализации процесса контаминации на практике. Но всегда ли контаминация в лаборатории сопровождается появлением ложноположительных результатов? По-нашему мнению, контаминация может быть скрытой и не приводить к появлению ложноположительных результатов. Поскольку каждая тест-система имеет свой порог (предел) обнаружения специфической ДНК, установка производителем высокого порога обнаружения искомой молекулы ДНК для своего диагностического набора позволит не определить низкие концентрации контаминационной молекулы ДНК как положительный результат лабораторного исследования. Ложноположительные результаты в данном случае следует воспринимать как надводную, меньшую часть айсберга. В процессе работы клинико-диагностической или научной лаборатории персонал может столкнуться с проблемой контаминации лабораторных поверхностей, дозаторов и даже лабораторного оборудования. Помня о возможности перемещения контаминационной молекулы ДНК с потоками воздуха, через контакты с одеждой, кожные и волосяные покровы, следует понимать, что контаминация – это неприятное, но, в то же время вполне возможное лабораторное событие.

Поэтому работа в лаборатории, использующей молекулярно-биологические методы диагностики, должна проводиться в режимных условиях с целым комплексом профилактических мер, направленных на недопущение возникновения контаминации и препятствие ее распространения, включая мониторинг для своевременного выявления неконтролируемой контаминации, тщательно фиксируя случаи ложноположительных результатов. В случае отсутствия ложноположительных результатов можно заключить, что, даже если контаминация и есть, ее распространение находится под контролем. Если в деятельности лаборатории регистрируются ложноположительные результаты, это указывает на то, что проводимых мероприятий недостаточно, необходимо выявить причины и принять меры, направленные на их устранение и на клиренс уже распространившейся контаминанты. Неоспоримым фактором контаминации является регистрация положительного результата в отрицательном контрольном образце.

Персонал лаборатории должен уметь своевременно отличить истинно положительные результаты от ложноположительных, а также определить причину и механизм возникшей контаминации. Для того чтобы устранить контаминацию, необходимо понять, что послужило контаминантой: ампликоны или нативная ДНК. Решить данный вопрос весьма проблематично, поскольку нет патогномоничных признаков. Ампликоны можно признать наиболее контагиозной из всех возможных контаминант, при этом происходит их ретроградный перенос из зоны ПЦР или пост-ПЦР в пре-ПЦР – это вертикальная, или внутренняя контаминация. При контаминации нативной ДНК задействуются ресурсы пре-ПЦР-зоны, когда контаминанта, не нарушая правил поточности, проходит этап амплификации – это горизонтальная, или внешняя контаминация. Важно охарактеризовать контаминацию посимптомно: низкокопийная или высококопийная, спорадическая или тотальная. Признаком тотальной контаминации является фиксация положительного результата в двух и более отрицательных контрольных образцах, спорадической – появление искомой ДНК лишь в одном отрицательном контрольном образце данной постановки. В случае, если контаминация вызвана нативной нуклеиновой кислотой, необходимо понять, каков механизм распространения контаминанта, чтобы конкретизировать свою тактику и наиболее эффективно провести мероприятия ликвидации контаминации.

Важно помнить, что контаминанта не может существовать сама по себе и ассоциирована с каким-либо носителем. Исключение составляют случаи, когда контаминанта переносится в воздухе, но это временное ее состояние, обязательно заканчивающееся осаждением на какой-либо объект. Любая контаминанта имеет первичный источник, то есть объект, который содержит ее в наиболее максимальном состоянии, это может быть пробирка с биологическим материалом или пробирка с ампликонами. Персоналу необходимо четко представлять, какой из объектов в лаборатории может выступать в качестве первичного источника контаминанты, чтобы с особым вниманием отнестись к нему во время проведения исследования с соблюдением всех мер предосторожности при обращении с ним. По мере распространения контаминанты в пределах лаборатории она охватывает новые территории, но ее концентрация при этом снижается. Те ареолы лаборатории, которые обсеменены контаминантой, являются очагом контаминации. Если первоначально не ликвидировать наиболее концентрированные скопления контаминанты в очаге – первичный источник, высококопийные вторичные источники контаминации, то итоговая эффективность деконтаминационных мероприятий будет низкой. Это устанавливает порядок деконтаминации, которую следует проводить поочередно: в начале – мероприятия в отношении наиболее концентрированных, а затем – в отношении менее концентрированных источников контаминации. Частота высококопийных контаминаций значительно ниже частоты низкокопийных. Наиболее часто контаминация проявляется регистрацией ложноположительного результата на поздних циклах амплификации. Более точная дифференцировка ложно- и истинно положительного результата возможна при повторном исследовании с проведением дублирования амплификации.

Для того, чтобы определить зоны с наиболее высокой концентрацией контаминанты, необходимо проводить внеплановые смывы, тестирование которых оправдано как в целях расследования механизмов контаминации, так и при оценке эффективности деконтаминационных мероприятий.

У каждой контаминации есть свой предел обнаружения, то есть та концентрация контаминанты, которая является максимально возможной в ложноположительном образце. Все результаты, когда регистрируемая концентрация искомой ДНК ниже предела обнаружения контаминации, должны рассматриваться как потенциально ложные, их следует повторно исследовать из резервного образца биологического материала – аликвоты. Считаем, что значения предела обнаружения внешней контаминации должен определять производитель тест-систем и предоставлять эти данные в инструкции к ней.

Риск контаминации биологических проб снижается при регулярных превентивных деконтаминационных мероприятиях, включая проведение текущей и генеральной уборки, ультрафиолетовое облучение рабочих зон. Поскольку существуют объекты труднодоступны для деконтаминации – штативы для наконечников, медицинский вакуумный отсасыватель, емкости для сбора наконечников, бумажные носители информации, следует проводить их периодическую замену, так как они являются местом сорбции и способны стать вторичным источником контаминанты.

Термин «перекрестная контаминация» обозначает внешнюю контаминацию в случае распространения от биологической пробы к биологической пробе. «Перекрестное реагирование» происходит в случае, если праймеры и зонды тест-системы сконструированы таким образом, что тест-система способна выявлять и детектировать не только заявленный возбудитель, но и другие виды микроорганизмов. Это указывает на то, что «перекрестное реагирование» не является синонимом термина «перекрестная контаминация».

В некоторых случаях источником контаминации может стать сотрудник клинико-диагностической лаборатории, особенно если объектом исследования является участок генома человека, поэтому следует соблюдать особую осторожность при проведении диагностических манипуляций. Обязательным является использование масок, медицинской шапочки, перчаток, исключение прикосновения к пробиркам, содержащим компоненты тест-систем без перчаток, поскольку ДНК самого сотрудника может стать контаминантой.

В коммерческих тест-системах контрольные образцы искомой (положительной) ДНК содержатся в невысоких концентрациях и укладываются в диапазон линейности теста. В этой связи их можно рассматривать как обычные биологические образцы, а контаминацию с их участием считать горизонтальной. Контаминацию реагентов следует рассматривать как возможное явление при любой контаминации, это вторичный источник контаминации, который может включать контаминацию воды и расходного материала. В качестве превентивных деконтаминационных мероприятий важно использовать пластик и реагенты с маркировкой DNA—free.

Профилактика контаминации должна включать общелабораторные меры, которые включают:

– отказ от открытых систем детекции результатов, использование тест-систем на основе ПЦР в режиме реального времени;

– соблюдение требований по организации работ в ПЦР-лаборатории, зонирование лабораторных этапов в соответствии с принципами поточного движения исследуемых биологических проб согласно последовательности прохождения ими этапов анализа; запрет на использование оборудования и расходных материалов за пределами той зоны, в которой предусмотрена их эксплуатация; разделение видов работ в отношении риска инициации контаминации и выполнение их в особых помещениях, смена спецодежды и гигиеническая обработка рук при перемещении между зонами;

– использование тест-систем с пределом обнаружения от 10² копий ДНК;

– использование одноразового пластика и других расходных материалов для проведения ПЦР-исследований;

– регулярная текущая и генеральная уборка с проведением мероприятий по дезактивации контаминанты;

– проведение внутрилабораторного контроля качества и участие во внешнем контроле качества.

Специальные меры профилактики контаминации.

1. Наличие отлаженной системы утилизации пробирок с ампликонами.

2. Использование UNG-протокола на основе урацил-N-гликозилазы – фермента, участвующего в репарации ДНК и вызывающего гидролиз цепи ДНК по остаткам урацила. При этом в ПЦР-смесь дезокситимидинфосфат заменяется на дезоксиуридинфосфат, поэтому ампликоны становятся чувствительными к UNG-гидролизу, после чего ампликоны не способны быть матрицей для последующей реакции амплификации. В случае неполной денатурации UNG, это может сопровождаться гидролизом исследуемых фрагментов положительной пробы и снижением чувствительности метода. Неполностью разрушенные с помощью UNG ампликоны, контаминируя пробы биологического материала пациентов, способны конкурировать с искомой нуклеиновой кислотой за праймеры, что обусловливает снижение чувствительности тест-системы и появление ложноотрицательных результатов.

3. Автоматизация процедуры экстракции нуклеиновых кислот, которая позволяет сократить частоту ложноположительных результатов до 1/400 [14]. Автоматизация ПЦР способствует уменьшению требуемых производственных площадей лаборатории, устранению дефицита кадров.

4. Сокращение числа этапов ПЦР, при выполнении которых требуется открывать пробирки. Современные тест-системы позволяют выполнять этап обратной транскрипции и амплификации в объединенной амплификационной смеси как один единый этап.

5. Ограничение количество исследуемых образцов в одну постановку до 12.

6. Ограничение количества циклов амплификации.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Костюк С.А. // Медицинские новости. – 2012. – №4. – С.16–19.

2. Костюк С.А. Клиническая лабораторная диагностика ассоциированных инфекций урогенитального тракта: Монография. – Минск, 2012. – 306 с.

3. Костюк С.А. // ARS medica (клин. лаборатор. диагностика). – 2010. – №4. – С.43–50.

4. Костюк С.А. Молекулярно-биологические методы в медицине: Монография. – Минск, 2013. – 327 с.

5. Костюк С.А., Коломиец Н.Д. // Медицинские новости. – 2008. – №15. – С.96–101.

6. Костюк С.А. // Весцi Нац. Акад. навук Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2006. – №4 – С.103–112.

7. Костюк С.А. // Медицинские новости. – 2016. – №4. – С.11–14.

8. Теоретические и прикладные вопросы применения методов анализа нуклеиновых кислот: монография / С.А. Костюк, Н.Д. Коломиец, Т.В. Руденкова, О.С. Полуян. – Минск, 2014. – 272 с.

9. Borst A., Box A.T., Fluit A.C. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2004. – Vol.23, N4. – P.289–299.

10. Burd E.M. // Clin. Microbiol. Rev. – 2010. – Vol.23, N3. – P.550–576.

11. Greub G., Sahli R., Brouillet R., et al. // Future Microbiol. – 2016. – Vol.11, N3. – P.403–525.

12. Tabrizi S.N., Unemo M., Limnios A.E., et al. // J. Clin. Microbiol. – 2011. – Vol.49, N10. – P.3610–3615.

13. Upton A., Bromhead C., Whiley D.M. // J. Clin. Microbiol. – 2013. – Vol.51, N5. – P.1609–1610.

14. Wilke W.W., Jones R.N., Sutton L.D. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 1995. – Vol.21, N4. – P.181–185.

15. Zitzer H., Heilek G., Truchon K., et al. // J.Clin. Microbiol. – 2013. – Vol.51, N2. – P.571–577.

Медицинские новости. – 2021. – №1. – С. 6-10.

Внимание! Статья адресована врачам-специалистам. Перепечатка данной статьи или её фрагментов в Интернете без гиперссылки на первоисточник рассматривается как нарушение авторских прав.