Ошибки при приготовлении питательных сред

Использование правильной питательной среды является одним из главных факторов успешных экспериментов в фармакологии. Однако, при работе с питательными средами могут возникать ошибки, которые могут негативно повлиять на качество результатов. 

В данной статье мы рассмотрим 5 главных ошибок, которые необходимо избегать при использовании питательных сред, особенно готовых питательных сред «Биомедиа».

1. Неправильное хранение готовых питательных сред «Биомедиа»

Одной из главных ошибок при работе с готовыми питательными средами «Биомедиа» является неправильное их хранение.

Готовые питательные среды «Биомедиа» могут быть особенно чувствительны к факторам окружающей среды, таким как температура, свет и влажность. Неправильное хранение может привести к снижению эффективности питательной среды или даже к ее загрязнению.

Для правильного хранения готовых питательных сред «Биомедиа», необходимо следовать инструкциям производителя. 

Обычно, готовые питательные среды должны храниться в темном и прохладном месте, вдали от прямых солнечных лучей и высокой влажности. Также, после использования питательную среду необходимо тщательно закрыть и хранить в охлажденном состоянии.

2. Использование устаревших готовых питательных сред «Биомедиа»

Готовые питательные среды «Биомедиа» имеют ограниченный срок годности, который может зависеть от типа, производителя и способа хранения. 

Использование устаревших готовых питательных сред «Биомедиа» может привести к снижению эффективности и точности результатов, а также повысить вероятность загрязнения среды.

При работе с готовыми питательными средами «Биомедиа» необходимо следить за их сроком годности и использовать только свежие среды, прошедшие необходимые проверки качества. 

Если вы замечаете признаки изменения цвета, текстуры или запаха готовой питательной среды «Биомедиа», необходимо немедленно заменить ее на новую.

3. Неправильное определение объема готовых питательных сред «Биомедиа»

Определение объема готовой питательной среды «Биомедиа» – один из важнейших этапов при работе с ней. 

Неправильное определение объема может привести к нежелательным результатам, искажению данных и неправильной интерпретации результатов эксперимента.

Для правильного определения объема готовой питательной среды «Биомедиа», необходимо использовать точные инструменты для измерения объема. 

Также, необходимо следить за тем, чтобы готовая питательная среда была правильно разбавлена, чтобы избежать излишней концентрации или разбавления.

4. Неаккуратное обращение с готовыми питательными средами «Биомедиа»

Готовые питательные среды «Биомедиа» могут быть подвержены загрязнению во время их подготовки или использования. 

Загрязнения могут происходить из-за неаккуратного обращения с готовой питательной средой, использования неочищенного оборудования или несоблюдения стерильности. Это может привести к нежелательным результатам, искажению данных и повышенной вероятности ошибок.

Для избежания загрязнения готовых питательных сред «Биомедиа», необходимо строго следовать протоколу эксперимента и использовать только чистое оборудование, которое было предварительно обработано специальными растворами или антисептиками. Также, необходимо соблюдать стерильность при работе с питательными средами, используя стерильные инструменты и помещения.

Готовые питательные среды «Биомедиа» имеют различные составы, которые могут быть оптимизированы для определенных типов клеток. Использование неподходящей готовой питательной среды для определенного типа клеток может привести к снижению эффективности и точности результатов.

При выборе готовой питательной среды «Биомедиа» необходимо учитывать оптимальный состав для конкретных типов клеток. 

Например, для культивирования элементов крови лучше использовать питательные среды с добавлением специальных факторов роста, а для культивирования клеток определенной линии – использовать питательные среды, оптимизированные для этой линии. 

Также, необходимо учитывать возможные аллергические реакции на некоторые компонентыготовых питательных сред «Биомедиа», которые могут возникнуть при использовании их для определенных типов клеток.

В заключении, готовые питательные среды «Биомедиа» – это важный инструмент в фармакологических исследованиях, который может обеспечить успешное проведение экспериментов. Однако, для достижения наилучших результатов необходимо избегать вышеупомянутых ошибок, которые могут негативно повлиять на качество эксперимента. 

Следуйте инструкциям производителя, учитывайте срок годности и оптимальный состав готовых питательных сред «Биомедиа», и соблюдайте стерильность и аккуратность при работе с ними. Это позволит вам достичь желаемых результатов и повысить эффективность ваших исследований.

«ОРГАНИЗАЦИЯ ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА САНИТАРНО — МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ВОДЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 2.1.4.1057-01» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.2001)

Качество питательных сред является одним из важнейших факторов, влияющих на достоверность результата анализа. Жесткая регламентация приготовления питательных сред и выполнения комплекса процедур внутреннего контроля качества является неотъемлемой частью обеспечения достоверности, а также воспроизводимости и повторяемости результатов количественных микробиологических анализов.

На конечный результат качества готовой питательной среды может оказать влияние множество различных моментов. Поэтому контроль качества питательных сред должен осуществляться на всех этапах технологического процесса, начиная от момента закупки среды до непосредственного использования в анализе, и включать следующие этапы:

1. Проверку документации и визуальный контроль питательных сред при их получении.

2. Контроль условий и сроков хранения питательных сред.

3. Контроль питательных сред на этапе приготовления.

4. Контроль биологических свойств питательных сред.

5. Контроль на этапе использования питательных сред.

Данный раздел регламентирует процедуры внутреннего контроля качества питательных сред, которые используются для выполнения текущего производственного и государственного санитарно-эпидемиологического контроля воды по санитарно-микробиологическим индикаторным показателям. Применение питательных сред без подтверждения их качества не допускается. Результаты выполнения процедур контроля качества должны быть документально зафиксированы.

11.1. Проверка документации и визуальный контроль питательных сред

Данный этап контроля позволяет избежать покупки продукции у фирм, не имеющих надлежащих документов, удостоверяющих и гарантирующих ее качество, а также выявить грубые нарушения, возникшие при транспортировании (разгерметизация упаковки, несоответствие внешнего вида обезвоженной среды или отдельных компонентов описанию изготовителя и др.). Контроль осуществляют при каждом поступлении в лабораторию новых сред.

При первом контакте с фирмой, производящей и (или) реализующей питательные среды, необходимо затребовать копии лицензии на право производства и реализации данных питательных сред. Обязательным условием поставки питательных сред является наличие следующих сопроводительных документов:

1. Копии сертификата соответствия на реализуемую среду.

2. Паспорта отдела контроля организации-изготовителя на реализуемую серию препарата.

3. Инструкции по применению.

Среды импортного производства должны иметь сертификаты качества серии ISO 9000.

При получении питательных сред необходимо проверить целостность упаковки (оценивается визуально) и наличие сопроводительной документации (сертификата соответствия, паспорта, инструкции по применению, этикеток на упаковках). Сопроводительная документация должна содержать следующую информацию:

— название среды и ее назначение;

— название предприятия-изготовителя;

— номер серии;

— номер протокола контрольных испытаний;

— дата изготовления;

— срок годности;

— состав среды;

— условия хранения;

— рецептура приготовления;

— описание внешнего вида и консистенции сухой и готовой среды;

— условия и длительность хранения готовой среды.

Обо всех обнаруженных отклонениях необходимо сообщить руководителю лаборатории.

11.2. Контроль условий и сроков хранения питательных сред

Данный этап контроля позволяет обеспечить правильность и постоянство условий хранения сред, а также своевременное пополнение их запаса.

Контроль осуществляют 1 раз в неделю или чаще.

Сухие питательные среды и реактивы, если не указаны особые условия хранения, необходимо поместить в сухое, защищенное от света место с температурой воздуха 10 — 25 °C.

Материалы, требующие пониженной температуры хранения, необходимо поместить в холодильник с соответствующей степенью охлаждения.

Особое внимание следует уделить сохранению герметичности вскрытых упаковок со средами, т.к. повышение влажности и комкование сухой питательной среды существенно ухудшает ее качество. Если питательная среда упакована в пакет из ламинированной бумаги и весь объем среды не используется за один раз, то после вскрытия пакета оставшуюся часть среды желательно перенести в чистую сухую емкость оранжевого стекла (или другого светозащитного инертного материала) с плотно закрывающейся крышкой.

Готовые питательные среды хранят при температуре (2 — °C. Срок хранения готовой питательной среды определяется изготовителем.

Сухие питательные среды с истекшим сроком годности, но с неизменившимися цветом и консистенцией, подвергают количественным методам контроля питательных сред по биологическим показателям с целью принятия решения о продлении срока годности.

Все приготовленные среды следует промаркировать с указанием названия среды, а также даты приготовления и срока годности. Дату приготовления питательной среды заносят в журнал (Прилож. 8.1).

Контейнеры (флаконы) с завинчивающимися крышками более пригодны для продолжительного хранения готовых жидких и плотных питательных сред, нежели чашки Петри или емкости с ватно-марлевыми пробками.

Температуру воздуха в местах хранения питательных сред проверяют 1 раз в неделю. Результаты проверки заносят в журнал регистрации температур.

11.3. Контроль питательных сред на этапе приготовления

Для приготовления питательных сред и растворов, используемых в микробиологическом анализе, допускается применение химических веществ по степени чистоты не ниже ЧДА. Требования к качеству воды для приготовления питательных сред для микробиологических анализов изложены в разделе 7.

При условии, что приобретена продукция надлежащего качества, одним из основных факторов, определяющих качество и дальнейшую пригодность питательной среды, является правильность ее приготовления.

Приготовление сред должно осуществляться со строгим соблюдением рецептуры приготовления и условий стерилизации, определенных изготовителем.

Контроль питательных сред на этапе приготовления включает:

— оценку внешнего вида готовой среды;

— измерение pH готовой среды;

— определение стерильности (отсутствия контаминации) готовой среды;

— постановку качественного контроля биологических свойств среды (раздел 11.4.1).

Контроль питательных сред на этапе приготовления проводят каждую варку.

11.3.1. Оценка внешнего вида готовой среды

Оценку внешнего вида питательной среды проводят визуально.

Цвет, прозрачность и консистенция сухой и приготовленной среды должны быть типичны для данного продукта и соответствовать описанию изготовителя.

Некоторыми очевидными ошибками при приготовлении сред являются:

— потемнение среды вследствие перегревания и недостаточного перемешивания;

— неполное растворение порошкообразной среды;

— образование осадка.

В агаризованных средах осадок может образовываться вследствие продолжительной стерилизации, повторных плавлений твердого агара или длительного содержания расплавленного агара при высокой температуре.

В этих случаях появление осадка свидетельствует о непригодности питательной среды.

Кроме того, агаризованные среды могут образовывать хлопьевидный осадок, если расплавленная среда остается в водяной бане при температуре от 43 до 45 °C более 30 мин., вследствие начинающегося процесса застывания агара. Такой хлопьевидный осадок агара можно рассеять путем повторного нагревания среды до 60 °C.

11.3.2. Измерение pH

Значение водородного показателя определяют с помощью pH-метра, для агаризированных сред — бумажной индикаторной системы с шагом измеряемого диапазона не более 0,3 единиц. Определение проводят согласно инструкции по использованию прибора или индикаторной системы.

Величину водородного показателя измеряют у стерилизованной среды, а при работе с плотной средой измеряют у стерилизованной среды после ее отвердения. Результаты регистрируют в журнале (Прилож. 8.1).

Отклонение pH среды за пределы диапазона, указанного в паспорте, приводит к ухудшению ее биологических свойств, вплоть до полной непригодности.

Отклонения водородного показателя или другие проблемы с pH могут быть вызваны:

— перегревом;

— недостаточным перемешиванием;

— чрезмерной стерилизацией;

— использованием щелочного стекла;

— загрязнением емкостей, в которых готовилась среда;

— дистиллированной водой низкого качества.

11.3.3. Определение стерильности

Определение стерильности (для стерилизуемых сред) и отсутствия контаминации (для нестерилизуемых сред) проводят путем инкубации чашки или пробирки с исследуемой средой в термостате при температуре и в течение времени, определенных для этих сред методическими документами по исследованию воды.

По истечении срока инкубации на (в) исследуемых питательных средах должны отсутствовать визуально определяемые признаки роста микроорганизмов.

Результаты регистрируют в журнале (Прилож. 8.1).

11.4. Контроль биологических свойств питательных сред

Оценка биологических (ростовых) свойств питательных сред проводится по следующим показателям.

Чувствительность — максимальное разведение тестовой культуры, при котором на всех засеянных чашках (во всех пробирках) обнаруживается рост.

Скорость роста — минимальное время инкубации после посева культур, достаточное для визуального выявления роста (выражается в часах).

Дифференцирующие свойства — оцениваются по выраженности основных отличительных признаков, характеризующих рост тестовых штаммов на данной питательной среде.

Кроме того, для дифференциальных сред необходимо определять ингибирующее действие среды. Ингибирующее действие среды определяется как в отношении основного тестового микроорганизма, так и по отношению к сопутствующим микроорганизмам.

Оценка ингибирующих свойств проводится по двум показателям.

Процент извлекаемости — процентное соотношение среднего значения количества колоний, выросших на исследуемой среде, к среднему значению количества колоний, выросших на контрольной среде.

Показатель ингибиции — степень подавляющего воздействия на постороннюю микрофлору, выражается минимальным разведением, при котором полностью отсутствует рост посторонней флоры.

Основным тестовым микроорганизмом для оценки биологических свойств среды, используемых для текущего санитарно-бактериологического контроля воды, является E.coli.

Дополнительно используются следующие тест-штаммы:

— для выявления дифференцирующих свойств среды — Shigella sonnei «S-form» в качестве вида, не ферментирующего лактозу;

— при определении показателя ингибиции посторонней микрофлоры — Staphylococcus aureus.

Контроль биологических свойств готовых питательных сред включает два этапа: качественный и количественный контроль, каждый из которых имеет свое целевое предназначение.

Задачей качественного контроля является выявление грубых нарушений технологии приготовления, приводящих к выраженному снижению ростовых и (или) дифференцирующих свойств. Качественный контроль проводят после каждой варки среды.

Количественный контроль позволяет выявлять относительные изменения (ухудшение) ростовых свойств из-за ряда причин, возникающих на этапах транспортирования, хранения, приготовления, стерилизации, а также при изменении технологических требований в процессе производства питательных сред, в результате которых они оказываются менее эффективными.

Количественный контроль выполняется:

— при поступлении каждой новой партии среды;

— при необходимости решения вопроса о продлении срока годности среды либо возможности ее дальнейшего использования в случае выявления нарушений условий хранения.

Учитывая, что разные серии питательных сред одного производителя иногда имеют различие по качеству, контролю подлежит каждая серия среды поступившей партии.

Количественный контроль также может служить инструментом выбора более эффективной среды среди продукции, предлагаемой на современном рынке.

11.4.1. Качественный контроль

В процессе качественного контроля оценивают принципиальную способность основного тестового штамма расти на данной среде, а также наличие характерных дифференцирующих признаков для специфических сред.

Качественный контроль выполняется лабораторией после каждой варки питательной среды.

Методика исследования

Накануне исследования тестовую культуру готовят, как указано в п. 10.2.4.

Контроль выполняют путем посева тестового штамма в жидкие, полужидкие или на плотные питательные среды с помощью общепринятых методик. Для плотных сред метод посева должен обеспечивать получение изолированных колоний микроорганизмов (например, метода «штриха»). Пробирки и чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.

Оценка результатов качественного контроля

Среду считают пригодной, если по истечении срока инкубации тестовый штамм дает хорошо различаемый рост со всеми типичными для него отличительными признаками, которые предполагается выявлять на данной среде.

Этими признаками могут быть: помутнение жидкой или полужидкой среды, изменение цвета, образование газа, отличительная форма, структура, окраска колоний, наличие и диаметр зоны изменения цвета и прозрачности среды вокруг колоний. Результаты качественного контроля заносят в журнал (Прилож. 8.1).

11.4.2. Количественный контроль

Выполнение количественного контроля должно осуществляться лабораторией, имеющей лицензию на работу с необходимыми патогенными микроорганизмами, аттестованной (аккредитованной) в этой области и располагающей персоналом соответствующей квалификации.

11.4.2.1. Подготовительный этап
Питательные среды

Для исследования следует использовать свежеприготовленные среды одной варки. Исследуемые и контрольные среды готовят согласно инструкции изготовителя.

Среды, предназначенные для прямого поверхностного посева, разливают в чашки Петри слоем не менее 2 мм и предварительно асептически подсушивают одним из следующих способов:

1. Перевернутые чашки Петри с открытыми крышками выдерживают в термостате или сушильном шкафу при температуре 25 — 50 °C до исчезновения капель влаги с поверхности агара. Не пересушивать!

2. Закрытые неперевернутые чашки Петри выдерживают в ламинарном боксе в течение ночи.

3. Чашки Петри с полуоткрытыми крышками помещают в ламинарный бокс на 30 мин.

В качестве неселективной среды при определении ингибирующих и дифференцирующих свойств контролируемой среды используют мясопептонный агар, питательный агар на основе гидролизата кильки, рыбной муки (ГРМ-агар) и их аналоги.

Разбавитель

Для исследования необходимо использовать стерильный физиологический раствор, содержащий 0,1% (по массе) пептона. Это сводит до минимума воздействие разбавителя на микроорганизмы. При невозможности приготовления данного разбавителя допускается использование стерильного физиологического раствора без пептона.

Подготовка инокулята

За два дня до исследования тестовую культуру микроорганизма пересевают со среды хранения на скошенный питательный агар согласно п. 10.2.4. На следующий день из полученной агаровой культуры с использованием стандарта мутности готовят суспензию

тестового штамма в стерильном разбавителе с концентрацией 10(9) кл/мл и десятикратные серийные разведения (по 8 разведение включительно) согласно п. 9.

Для контроля разбавления из 6 и 7 разведения высевают по 0,1 мл (100 мкл) суспензии прямым поверхностным посевом на чашки с питательным агаром. Из каждого разведения делают по три таких посева. После высева пробирки с разведениями немедленно переносятся в холодильник. Чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.

В день исследования для каждой серии посевов подсчитывают среднее число колоний, выросшее на трех чашках. При правильно выполненном разведении среднее количество колоний, выросших при посеве 0,1 мл суспензии тестового микроорганизма из 6-го разведения, должно составлять около 100 КОЕ. Соотношение полученных средних значений при посеве из 6 и 7 разведений должно быть близко к 10:1.

В случае, если концентрация микроорганизмов в разведениях значительно отклоняется от расчетной и (или) не соблюдена кратность разведения, данный инокулят тестового штамма не пригоден для дальнейшего использования. Подготовку инокулята необходимо повторить.

Для показателей, требующих определения количества внесенных микроорганизмов, рассчитывают посевную дозу. Посевная доза — объем конкретного разведения, содержащий необходимое для посева количество жизнеспособных клеток тестового микроорганизма. Расчет дозы выполняют, основываясь на ранее определенных концентрациях тестового микроорганизма в 6 и 7 разведениях, исходя из требований, что посев на одну чашку не должен превышать 50 — 100 микробных клеток. При правильно выполненном разведении посевная доза составляет 50 — 100 мкл суспензии из 6 разведения.

После расчета посевной дозы определяют необходимое количество повторов посевов (не менее 5) исходя из расчета, что суммарное количество колоний на всех чашках на одной среде должно составлять не менее 200 КОЕ.

Приготовленные суспензии можно использовать, если они были охлаждены сразу же после приготовления и произведения контрольных высевов и не хранились более 24 часов. Перед исследованием инокулят следует тщательно перемешивать, чтобы добиться однородности суспензии микроорганизмов.

11.4.2.2. Методики посевов
Посев в жидкую питательную среду

Данный метод посева используется при количественном определении показателей ростовых и дифференцирующих свойств жидких и полужидких питательных сред. Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Посевную дозу суспензии асептически помещают при помощи пипетки в пробирку с исследуемой питательной средой и перемешивают. Инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.

Посев прямым поверхностным методом

Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Посевную дозу суспензии асептически помещают при помощи пипетки на поверхность заранее подготовленной питательной среды (п. 11.4.2.1). Стерильным шпателем культуру распределяют по поверхности питательного агара, чтобы добиться равномерного распределения инокулята. После впитывания инокулята чашки переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.

11.4.2.3. Определение показателей «чувствительности» и «скорости роста»
Методика исследования

При определении показателей чувствительности и скорости роста используют по 0,1 мл из 5, 6, 7 и 8 разведений для посева на плотные питательные среды и по 1,0 мл из 4, 5, 6, 7 — для посева в жидкие среды. Разведения готовят и контролируют, как указано в п. 11.4.2.1.

Посев каждой дозы инокулята выполняют не менее чем на 3 чашки или пробирки в соответствии с пунктом 11.4.2.2. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 часов. Визуальный учет скорости роста культуры в каждом взятом в опыт разведении микробной взвеси производят для плотных сред через 12 и 24, а для жидких — через 3, 6 и т.д. часов инкубации.

Оценка результата

Чувствительностью среды считается наибольшее разведение исходной суспензии тестового штамма с исходной концентрацией около

9 10 КОЕ/мл, обеспечивающее формирование колоний на всех засеянных чашках или визуально видимый рост во всех пробирках с исследуемой средой.

Чувствительность среды должна соответствовать параметру, указанному изготовителем в паспорте данной среды. Если данный параметр изготовителем не указан, то чувствительность должна составлять не менее чем 0,1 мл суспензии из 6 разведения для плотных и 1 мл суспензии из 7 разведения для жидких питательных сред.

При отсутствии роста в одной пробирке или на одной чашке с посевом разведения, указанного в паспорте как чувствительность, опыт повторяется на удвоенном числе пробирок или чашек. Приемлемым считается наличие роста в 5 посевах оцениваемого разведения из 6. Если при повторном исследовании чувствительность среды не соответствует паспортному значению, то ее бракуют.

Скорость роста контрольной культуры — минимальное время инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливый, видимый невооруженным глазом рост культуры во всех пробирках с жидкими питательными средами (помутнение, наличие пленки, изменение цвета среды) или формирование типичных, легко дифференцируемых колоний на чашках с плотной средой.

Скорость роста не должна превышать время инкубации, указанное в нормативных документах для исследований, в которых эта среда используется.

Результат заносят в протокол оценки питательной среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).

11.4.2.4. Оценка дифференцирующих свойств среды Эндо и ее аналогов

Для оценки дифференцирующих свойств сред используют два тестовых штамма, отличающихся по основному дифференцируемому признаку ферментации лактозы E.coli (Lac+ ) и Shigella sonnei (Lac- ).

Подготовка инокулятов

Разведения тестовых штаммов готовят, как указано в п. 11.4.2.1. Посевная доза должна содержать 50 — 100 микробных клеток на чашку, рассчитанная по контрольному посеву.

Методика исследования

Из разведений тестовых штаммов, содержащих исходя из контрольных посевов 500 — 1000 микробных клеток в 1 мл, готовят 3 смеси:

1. По 1 мл каждого штамма E.coli (Lac+ ) и Shigella sonnei (Lac- ).

2. По 1 мл штамма E.coli (Lac+ ) и разбавителя.

3. По 1 мл штамма Shigella sonnei (Lac- ) и разбавителя.

Приготовленные смеси тщательно перемешивают. Из каждой смеси в соответствии с рассчитанной посевной дозой (по 50 — 100 мкл) засевают поверхностным методом не менее чем на 3 чашки с исследуемой средой. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.

По окончании инкубации учитывают выраженность дифференциальных признаков при росте колоний тестового микроорганизма

E.coli (Lac+ ), ферментирующего лактозу на исследуемой среде (характерный цвет колоний, среды), и их отсутствие в посевах тестового штамма Shigella sonnei (Lac- ), не обладающего способностью к ферментации лактозы.

Оценка результатов

Дифференцирующие свойства среды считают удовлетворительными, если она обеспечивает определенный в паспорте перечень признаков и степень их выраженности у тестового штамма, обладающего искомыми свойствами. Результат заносится в протокол оценки питательной среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).

11.4.2.5. Определение процента извлекаемости (% всхожести)

Этот показатель позволяет выявить и оценить наличие и степень ингибирующего влияния исследуемой среды на E.coli по сравнению с контрольной средой. В качестве контрольной используют ранее проведенную неселективную среду.

Определение процента извлекаемости (% всхожести) особенно важно для сред, используемых в методах прямого количественного подсчета (прямой посев исследуемой воды на чашку или фильтр), где наличие даже относительного ингибирующего влияния среды на искомые микроорганизмы будет искажать результат и снижать чувствительность метода.

Методика исследования

Готовят инокуляты для посева и осуществляют расчет посевной дозы, как указано в п. 11.4.2.1. Посев на контрольную и исследуемую среду выполняют прямым посевом согласно п. 11.4.2.2.

Чашки с посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.

После инкубации подсчитывают количество колоний, выросших на каждой чашке. Общее количество колоний во всех повторах (не менее 5) на контрольной неселективной среде должно быть не менее 200. Вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на контрольной и исследуемой средах.

Обработка результатов

Процент извлекаемости рассчитывают по формуле:

— процент всхожести на исследуемой среде;

— среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на исследуемой среде;

— среднее арифметическое значение количества колоний, выросших на контрольной среде.

Оценка результатов

Среда признается приемлемой при условии, что различие между средними значениями количества колоний на контрольной и исследуемой средах недостоверно. При этом, как правило, % извлекаемости (всхожести) составляет не менее 80%.

Расчет достоверности различий средних значений количества колоний, выросших на контрольной и исследуемой средах, приведен в Прилож. 10.

Результат заносится в протокол количественной оценки питательной среды по биологическим показателям (Прилож. 8.2).

В случае получения достоверного различия результатов исследование повторяют, удваивая количество повторов: не менее 10 чашек с общей численностью количества учитываемых колоний на неселективной среде не менее 400.

11.4.2.6. Оценка показателя ингибиции

Для оценки ингибирующих свойств среды Эндо (и ее аналогов) по отношению к микробам-ассоциантам используют тестовый штамм Staphylococcus aureus.

Подготовка инокулята

Разведения тестового штамма готовят и контролируют, как указано в п. 11.4.2.1.

Методика контроля

Взвесь штамма-ассоцианта из разведений 10(-1) (10(8) микробных клеток в мл) по 100 мкл засевают на 3 чашки Петри с испытуемой и контрольной (неингибиторной) средами. В качестве контрольной среды используется питательный агар. Через 24 — 48 часов инкубации при температуре (37 +/- 1) °C определяют число колоний, сформировавшихся на испытуемой и контрольной средах.

Оценка результатов

Ингибирующие свойства среды являются удовлетворительными, если в разведении 10(-1) отсутствует рост микроба-ассоцианта при наличии роста в контрольных посевах. Результат заносят в протокол оценки питательной среды (Прилож. 8.2).

11.4.3. Рекомендации по сравнительной оценке эффективности питательных сред с использованием мембранных фильтров

Основным методом концентрирования в санитарно-бактериологических исследованиях воды является фильтрование через мембранные фильтры. Введение дополнительного фактора, мембранного фильтра, в систему «микроорганизм — питательная среда» может оказать влияние на показатели роста микроорганизмов и биологические свойства среды.

В настоящее время ведущие зарубежные производители питательных сред выпускают среды, обеспечивающие своим составом оптимальные условия роста микроорганизмов при использовании мембранных фильтров и целенаправленно предназначенные для исследования воды мембранным методом. В отличие от своих аналогов для клинических исследований или прямых посевов воды без концентрирования эти среды имеют индекс m, например: m Endo agar.

В нашей стране подобные среды пока не производятся и в нормативных требованиях к качеству питательных сред такой важный момент, как комплексная оценка системы «микроорганизм — фильтр — среда», не нашел отражения.

Тем не менее, в случаях необходимости сделать выбор между средами, предлагаемыми разными производителями, оценка качества среды в комплексе с используемыми в анализе мембранными фильтрами, наряду с перечисленными в п. п. 11.1 — 11.4.2 исследованиями, будет способствовать повышению объективности получаемых результатов, а в отдельных случаях может стать определяющим фактором в принятии решения.

Однозначно признано, что исследования, выполненные на чистых культурах модельных микроорганизмов, не могут учесть влияния всего многообразия микроорганизмов естественных водоемов. В этой связи, при проведении сравнительной оценки дифференцирующих и ингибирующих свойств различных сред, может оказаться полезным использование природной воды для приближения к натурным условиям.

Однако при выполнении этих исследований необходимо всегда иметь в виду наличие индивидуальных особенностей каждого водоема, а также нестабильность во времени как микробиологических характеристик природных вод, так и уровней химического загрязнения. Эти факты существенно снижают важность полученных результатов и ограничивают их применение конкретным водоемом.

С учетом изложенного описанная методика носит рекомендательный характер.

11.4.3.1. Подготовительный этап
Мембранные фильтры

Процент извлекаемости используемых мембранных фильтров должен составлять не менее 80% на полноценной неселективной среде. Мембранные фильтры должны быть стерильными.

Питательные среды

Питательные среды для посева мембранных фильтров не подсушиваются, но на поверхности разлитых в чашки сред не должно быть видимой влаги.

Подготовка инокулята

Подготовку инокулята тестовых культур микроорганизма осуществляют, как указано в п. 11.4.2.1. В качестве тестовой культуры используют модельный штамм E.coli M17-02. Посевная доза на фильтр должна составлять от 25 до 100 КОЕ для фильтров диаметром 47 мм и 25 — 60 КОЕ для фильтров диаметром 35 мм.

Расчетное засеваемое общее количество тестовых микроорганизмов должно быть не менее 200, при количестве повторов — не менее 5.

Природная вода используется как естественный источник водных сапрофитов для оценки ингибирующих и дифференцирующих свойств исследуемых сред. За сутки до начала исследований природная вода, предназначенная для подготовки инокулята, должна быть оценена по общепринятым методикам на общее содержание микроорганизмов (ОМЧ) и наличие искомых колиформных микроорганизмов и до начала основных исследований помещена в холодильник.

По результатам выполненных контрольных посевов рассчитывают необходимый объем природной воды. Объем инокулята природной воды должен содержать сотни — тысячи сапрофитных микроорганизмов. Использование обедненных по микробному составу природных вод в данных исследованиях нецелесообразно.

В установленный по содержанию сапрофитных микроорганизмов объем природной воды вносят расчетную посевную дозу тестового микроорганизма (E.coli).

Если природная вода содержит достаточное количество колиформных бактерий для посева требуемого количества на один фильтр, модельные микроорганизмы не используются. При необходимости природная вода может быть разведена в 10 и более раз.

11.4.3.2. Посев методом мембранной фильтрации

Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Предварительно рассчитанную посевную дозу суспензии вносят в пробирки, содержащие не менее 10 мл разбавителя. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Количество пробирок, содержащих посевную дозу тестового микроорганизма, должно соответствовать количеству предполагаемых посевов методом мембранной фильтрации.

Фильтровальную установку готовят согласно общепринятым процедурам. Контроль стерильности фильтровальной установки проводят, как указано в п. 6.5. Стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр на основание держателя фильтра и присоединяют фильтровальную воронку. При отключенном вакууме прибавляют 20 — 30 мл стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды. Содержимое пробирки с посевной дозой тщательно перемешивают и асептически переносят в воронку с разбавителем, включают вакуум и отфильтровывают.

Дважды, при включенном вакууме, ополаскивают воронку 20 — 30 мл стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды.

Вакуум отключают, снимают фильтровальную воронку и стерильным пинцетом переносят мембранный фильтр с основания на питательную среду. Между мембранным фильтром и поверхностью агара не должно быть пузырьков воздуха. Чашки с посевами переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 часов.

Посев инокулята природной воды осуществляется аналогично описанному выше с коррективами в отношении объема инокулята природной воды, который может быть 10 мл и более. В этом случае вносят соответствующее меньшее количество разбавителя или стерильной дистиллированной воды. Обязательно проводят двойное споласкивание воронки, как указано выше.

11.4.3.3. Методика сравнительных исследований

На первом этапе осуществляют отбор сред по параметрам, описанным в п. п. 11.1 — 11.3, 11.4.1 — 11.4.2.4.

На втором этапе отобранные среды оценивают по показателю «процент извлекаемости» с использованием двух способов посевов: прямого (по п. 11.4.2.5) и методом мембранных фильтров. Для каждой исследуемой среды и варианта посева должно быть выполнено не менее 5 повторов. Контролями служат прямой посев (контроль N 1) и посев мембранным методом (контроль N 2) на неселективную среду.

При необходимости могут быть проведены параллельные дополнительные исследования с инокулятом природной воды. Инокуляты природной воды с внесенными тестовыми микроорганизмами (или без них) засевают методом мембранных фильтров на исследуемые селективные среды.

Учет результатов

Рассчитывается среднее количество колоний для каждой среды, способа посева и контрольных посевов. Общее количество колоний тестового микроорганизма на неселективной среде при посеве прямым методом должно быть не менее 200.

Согласно разделу 12 подтверждают качество используемых в эксперименте мембранных фильтров путем расчета «процента извлекаемости» для мембранных фильтров по средним результатам контрольных посевов (прямого N 1 и мембранного N 2) на неселективный агар.

Далее по п. 11.4.2.5 производят расчет процента извлекаемости и оценку достоверности различий для исследуемых сред. Контрольным результатом при этом служит среднее количество колоний, выросших при прямом посеве на неселективном агаре (контроль N 1).

При посевах природной воды с дополнительным внесением тестовых микроорганизмов в дальнейших расчетах учитывают полученные накануне результаты контрольного посева на наличие колиформ. Далее процент извлекаемости рассчитывается так же, как и в исследованиях с чистыми культурами: в сравнении с результатами прямого посева тестовых микроорганизмов на неселективный агар (контроль N 1).

В случае посевов природной воды без дополнительного внесения тестовых микроорганизмов оценивают достоверность различий результатов, полученных при посевах на исследуемые среды.

При получении недостоверных различий результатов исследований для выбора наиболее оптимальной среды необходимо проанализировать следующие характеристики:

— четкость проявления дифференцирующих признаков для тестового микроорганизма;

— подавление сопутствующей микрофлоры;

— выявление ингибирующего действия микробного населения природной воды на тестовую культуру Е.coli.

11.5. Контроль на этапе использования питательных сред

В процедуре анализа возможны нарушения использования питательных сред (перегрев, чрезмерная инкубация при высокой температуре и т.д.), приводящие к ухудшению их ростовых свойств. Кроме того, возможно неверное толкование полученного результата вследствие слабой выраженности признака у исследуемого микроорганизма. Контроль на этом этапе позволяет минимизировать подобные проблемы.

Контроль сред на этапе использования включает:

— контроль температурного режима водяных бань, предназначенных для поддержания плотных питательных сред в расплавленном состоянии;

— учет времени нахождения среды в расплавленном состоянии;

— постановку положительного и отрицательного контролей в процессе идентификации микроорганизмов.

Данный вид контроля проводится при каждом использовании питательных сред.

11.5.1. Контроль температурного режима водяных бань, предназначенных для поддержания плотных питательных сред в расплавленном состоянии

Температура водяной бани должна находиться в пределах (47 +/2) °C.

11.5.2. Контроль времени нахождения питательной среды в расплавленном состоянии

Питательная среда не должна находиться в расплавленном состоянии более 8 часов. Повторное плавление плотной питательной среды не допускается.

11.5.3. Постановка положительного и отрицательного контролей

Постановку контролей осуществляют в процессе идентификации микроорганизмов при выполнении подтверждающих тестов.

Тестовые культуры

В качестве тестовой культуры используют штамм Е.coli M17-02. Подготовка инокулята. Накануне исследования тестовую культуру готовят, как указано в п. 10.2.4.

Методика контроля

Постановку положительного контроля осуществляют путем внесения одной петли агаровой культуры тестового штамма в пробирку с используемой средой (средами) для идентификации. Отрицательным контролем служит пробирка с аналогичной средой без посева. Обе пробирки маркируют и помещают в термостат вместе с посевами.

Учет результатов

По истечении срока инкубации в пробирке с положительным контролем должен наблюдаться хорошо различаемый рост, со всеми типичными для него отличительными признаками, которые предполагается выявлять на данной среде. Цвет индикатора среды должен изменяться на цвет, определяемый в паспорте среды, как положительный результат утилизации данного углевода. В пробирке с отрицательным контролем среда должна находиться без изменений. Результаты положительного и отрицательного контролей заносятся в рабочий журнал основного исследования.

11.6. Ростовые характеристики ряда сред отечественного производства, применяемых в санитарно-бактериологическом анализе воды
ГРМ-бульон, питательный бульон и их аналоги

В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма Е.coli в виде диффузного помутнения среды не позднее 18 — 24 часов инкубации при (37 +/- 1) °C. В количественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма во всех пробирках при посеве 1,0 мл из разведения 10(-7) не позднее 20 — 24 часов инкубации при (37 +/- 1) °C.

ГРМ-агар, питательный агар и их аналоги

В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма Е.coli в виде бесцветных прозрачных круглых колоний в S-форме не позднее 20 — 24 часов инкубации при (37 +/1) °C. В количественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма Е.coli в виде бесцветных прозрачных круглых колоний в S-форме на всех чашках при посеве 100 мкл (0,1 мл) из разведения 10(-6) не позднее 18 — 20 часов инкубации при (37 +/- 1) °C.

Если среду предполагается использовать в качестве контрольной в исследовании по определению показателя ингибиции, то процент всхожести должен составлять не менее 80% по сравнению со средой ранее проверенной партии, а различие между ними должно быть недостоверно.

Агар Эндо с добавками

В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма Е.coli в виде красных (малиновых) с металлическим блеском круглых колоний диаметром 2,0 — 3,0 мм, с образованием зоны потемнения среды вокруг колонии («отпечатка») не позднее 20 — 24 часов инкубации при (37 +/- 1) °C.

В количественном контроле среда должна обеспечивать рост типичных колоний Е.coli на всех чашках при посеве 100 мкл (0,1 мл) из разведения 10(-6) не позднее 18 — 20 часов инкубации при (37 +/1) °C.

При посеве смеси тест-штаммов должна наблюдаться четкая дифференциация колоний: в отличие от малиновых колоний Е.coli колонии шигелл более мелкие с окраской от белого до слабо-розового цвета, без отпечатка на среде.

Среда должна подавлять рост Staphylococcus aureus при посеве 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10(-1).

Среды с лактозой и глюкозой (жидкие и полужидкие)

В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового штамма в виде диффузного помутнения среды не позднее 18 — 24 часов инкубации при (37 +/- 1) °C. При этом цвет индикатора среды должен изменяться на цвет, определяемый в паспорте среды как положительный результат утилизации данного углевода до кислоты, визуально должно определяться образование газа в виде наполненных и (или) спавшихся пузырьков в толще полужидкой среды или скопления газа в поплавке для жидкой среды.

Количественный контроль для данных сред не проводится.

Железосульфитный агар

Данная среда не выпускается отечественной промышленностью в виде обезвоженного полуфабриката, а готовится из составных частей ex temporo, что исключает возможность ее стандартизации. Это приводит к колебаниям качества среды от варки к варке, что зависит от целого ряда факторов.

Поэтому вопрос о контроле данной среды или ее аналогов на уровне производственной лаборатории остается открытым.

Раздел составлен на основе следующих документов:

международного стандарта ISO 9998:1991 (E) «Качество воды — методы оценки и контроля сред, предназначенных для подсчета колоний микроорганизмов, используемых при тестировании качества воды»;

Методических рекомендаций к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980;

бактериологического контроля питательных сред. Методические рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и больниц: МЗ РСФСР. Хабаровск, 1979;

ФС 42-3377-97 «Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)»;

ФС 42-3378-97 «Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон)»;

ФС 42-3504-97 «Питательная среда для выделения энтеробактерий сухая (агар Эндо)».

Инструкции общего назначения для потребителя

Вводные указания

Питательные среды имеют тенденцию к образованию комков (слеживанию) в следующих условиях:

• при повышенной влажности во время хранения;
• если контейнер длительное время открыт;
• если контейнер постоянно неплотно закрывают;
• если среда очень старая.

Восстановление сухих сред Для приготовления среды используйте чистую, неповрежденную стеклянную посуду и дистиллированную или деионизированную воду, соответствующую требованиям Фармакопеи США и Международной фармакопеи для чистой воды.  Поместите навеску среды в чистую, сухую колбу, объём которой в 2-3 раза превышает окончательный объём готовой среды. Добавьте часть приготовленного количества воды и перемешивайте вращательными движениями до растворения. Затем понемногу, по стенке колбы, добавляйте оставшееся количество воды. Большинство бульонов на этой стадии полностью растворяются и выглядят прозрачными. Для полного растворения используйте открытое пламя, горячую плиту или кипящую воду, избегая чрезмерного нагрева и подгорания среды.

Подведение рН

Обычно сухие среды, восстановленные с использованием дистиллированной или деионизированной воды, при 25 °С имеют те значения рН, которые указаны на этикетке. Тем не менее рекомендуется, особенно при использовании давно хранящихся сред, проверять и при необходимости корректировать значение рН.
Измерение рН у жидких сред следует проводить при 25 °С, а у расплавленных плотных – при 40-45 °С. Значение рН доводят до необходимого путем добавления 1 N или 0,1 N растворов соляной кислоты или гидроксида натрия к определенному объему образца (например, к 50 или 100 мл среды). После перерасчета к оставшемуся объему среды добавляют необходимое количество кислоты или щелочи.

Стерилизация

Полностью приготовленную среду стерилизуйте, как указано на этикетке.
Обычно стерилизацию проводят в автоклаве, 15 минут при 121° С. Соотношение температур и давлений приведено в Таблице 1.

Таблица 1. Соотношение температур и давлений

Давление насыщеного пара в автоклаве, кПа Температура, ° С
34,47	108
68,95	116
103,42	121
137,90	127
172,37	131
206,84	134
1 атм.=101,325 кПа

Время от время необходимо проверять эффективность автоклавирования. Температурные условия в разных точках рабочей камеры автоклава неодинаковы. Их можно проверить с помощью двух флаконов с 2 %-м раствором глюкозы в 2 %-м растворе гидрофосфата натрия, которые помещают в разные места рабочей камеры. Нагревание придаёт раствору коричневый цвет. Содержимое флакона, расположенного около отверстия для поступления пара, имеет более интенсивную коричневую окраску, чем у содержимого других флаконов.
При стерилизации настоятельно рекомендуется точно следовать указаниям на этикетке.
Перед введением термолабильных добавок в простерилизованную среду ее необходимо остудить. Добавки асептически вводят в жидкую среду, охлаждённую до комнатной температуры, или в питательный агар, охлажденный до 50-55° С, как указано на этикетке.

Контроль стерилизации

Все автоклавы необходимо регулярно проверять на эффективность и действенность.
Физическими параметрами контроля являются температура и давление пара. Надо проверять также насыщенность пара и безопасность работы клапанов. В России и некоторых других странах в программу контроля работы автоклава включают биологические тесты, демонстрирующие эффект стерилизации.
Физико-химические тесты показывают, достигалась ли при стерилизации заданная температура, а некоторые из них показывают и достаточность экспозиции при данной температуре.

Влияние перегрева

Высокие температуры и длительный нагрев являются обычной причиной сдвига рН, потемнения питательных сред, выпадения преципитата, плохого гелеобразования и потери качества питательной среды в целом. Предполагается, что все стерилизуемые среды находятся в виде раствора, в противном случае возможно потемнение среды (реакция Мейларда).

Розлив стерильных сред в чашки Петри

1. Во избежание появления обильного конденсата на крышках чашек стерильные агаровые среды перед розливом должны иметь температуру 45-50 °С. Среду надо тщательно перемешать, не допуская образования пузырьков воздуха, асептически разлить в чашки Петри. Перед посевом поверхность агаровых сред должна быть подсушена в асептических условиях при 30-40 °С в термостате.
2. Добавление крови: для приготовления кровяного агара лучше использовать дефибринированную кровь, чем кровь с антикоагулянтами. Лучше использовать как можно более свежую кровь, а если она находилась на хранении (при +2…8 °С, без замораживания), то ее предварительно подогревают до 35-37 °С в термостате, а затем добавляют в расплавленную агаровую основу при температуре 45-50 °С.

Хранение приготовленных сред

Если среда не использована в день приготовления, её для предотвращения высыхания, необходимо хранить в плотно закрытом контейнере. Важно отметить, что во избежание потери стабильности готовых жидких сред, их не следует хранить в течение длительного времени. Агаровые среды, также во избежание порчи, не должны подвергаться длительному воздействию высоких температур (40-50 ° С).

При работе следует отдавать предпочтение свежеприготовленным средам. Питательные среды с такими лабильными веществами, как бета-лактамные антибиотики, во избежание потери активности последних, надо использовать в течение нескольких дней после приготовления.
Чашки с агаровыми средами следует хранить при +2…8 °С в плотно закрытых контейнерах для предотвращения влагопотери. Жидкие среды в пробирках и флаконах также желательно закрывать герметично. Испарение влаги может привести к кристаллизации некоторых компонентов среды.
Стабильность приготовленных сред ограничена и значительно варьирует. Если нет специальных указаний, то среды можно хранить при 12…15 °С в течение нескольких месяцев. Не рекомендуется хранить среды при отрицательных температурах, так как при этом нарушается структура геля.
Перед посевом чашки тщательно проверяют на отсутствие контаминации, неровностей агаровой поверхности, пузырьков, изменений цвета, гемолиза и разрывов, вызванных с усыханием среды. Пробирки и чашки с такими дефектами выбрасывают.

Утилизация использованных сред

1. Условия лаборатории: микробиологическая лаборатория представляет опасность для непосвященных и необученных лиц, поэтому степень риска уменьшается для тех, кто знает о возможных опасностях и принципах безопасного поведения в лаборатории. Всегда следует учитывать условия, в которых проводятся манипуляции с микробными культурами. В большинстве стран приняты стандарты для таких условий, в зависимости от типа используемых микроорганизмов и категории микробиологической лаборатории. Для работы с наиболее опасными микроорганизмами предписывается выполнение полного комплекса мер безопасности. Пренебрежение этими инструкциями и правилами может рассматриваться как правонарушение.
2. Действия персонала: к работе с инфицированным материалом и засеянными питательными средами допускается только квалифицированный персонал, обученный обращению с микробиологическими материалами. Со всеми образцами исследуемого материала и микробными культурами надо обращаться должным образом и допускать их сбрасывания без уничтожения в автоклаве. Пользователь должен убедиться в отсутствии микробной контаминации оборудования и аппаратуры, а при подозрении на нее — применять дезинфицирующие средства или автоклавирование. Ненужные микробные культуры в стеклянной посуде (флаконах, пробирках, чашках Петри) в первую очередь должны убиваться автоклавированием (примерно 30 мин при 121 °С).
3. Биологическая безопасность: необходимо понимать, что посев микроорганизмов на питательные среды приводит к резкому возрастанию их численности. В таких высоких концентрациях любой микроорганизм потенциально опасен, поэтому для предотвращения заражений микробные культуры необходимо утилизировать соответствующими безопасными методами.

Обращение с сухими питательными средами

Все сухие питательные среды поставляются в виде тонкого порошка. Данные продукты предназначены для бактериологической работы в лаборатории, как указано на соответствующих этикетках, и не должны прямо или косвенно использоваться для потребления людьми или животными. Большинство продуктов представляет собой мелкодисперсные летучие порошки, поэтому следует избегать их вдыхание, чтобы не вызвать раздражение верхних дыхательных путей. Не допускайте длительного контакта порошка с поврежденной кожей или избыточного пыления порошка. Любые остатки порошка следует смывать большим количеством холодной воды.

Для предупреждения попадания аэрозолей порошка питательных сред в дыхательные пути рекомендуется использовать индивидуальные защитные маски.
Каждая питательная среда сопровождается специальной инструкцией по приготовлению и применению.

Обращение с опасными и токсическими продуктами

Символы опасности

Многие питательные среды могут содержать в качестве компонентов токсические вещества, поэтому с ними надо обращаться так, как указано в разделе “Меры безопасности” инструкции. Если в материале имеются какие-либо токсические субстанции, на этикетке имеются соответствующие обозначения и фразы.

Натрия азид: Обычно при использовании в составе любой среды его концентрация не превышает 1 %, что соответствует низкой токсичности. Тем не менее, некоторые лица проявляют повышенную чувствительность к этому веществу, поэтому надо принимать меры к предотвращению вдыхания или попадания порошка азида натрия внутрь. Это вещество имеет свойство реагировать со многими металлами, особенно, медью и свинцом, с образованием взрывчатых соединений – азидов металлов. В связи с этим рекомендуется строго следовать положениям местного или национального законодательных актов по утилизации азида натрия. Для предотвращения длительного контакта с металлическими водостоками и канализационными трубами следует смывать остатки этого порошка большим количеством воды. Эти же предосторожности необходимы при использовании любой биологической жидкости, содержащей азид натрия в качестве консерванта.

Лития хлорид: Эта соль является опасным веществом, поэтому надо избегать контакта с ней любого участка тела или вдыхания паров. При попадании на кожу хлорида лития ее надо промыть большим количеством воды.

Циклогексимид: Это высоко токсичное соединение, поэтому следует избегать его попадания на кожу, образования аэрозолей и вдыхания их.

Фуксин основной: Является потенциальным канцерогеном, поэтому требуется осторожность, чтобы не допустить его вдыхания порошка или контакт с кожей.

Натрия гидроселенит: Это высоко токсичное соединение с тератогенными и коррозионными свойствами, поэтому при обращении с ним требуется особая осторожность. При попадании на кожу гидроселенита натрия ее надо промыть большим количеством воды.

Первая помощь

При несчастных случаях, связанных с неосторожным обращением с опасными или токсическими веществами, рекомендуются следующие мероприятия первой помощи пострадавшим.

Вдыхание: Вывести пострадавшего из зоны воздействия вещества, согреть и при необходимости обратиться за медицинской помощью.

Контакт с кожей: Немедленно удалить всю загрязненную веществом одежду и тщательно промыть водой с мылом загрязненный участок кожи. При наличии симптомов отравления по завершении указанных процедур обратиться за медицинской помощью.

Попадание внутрь: Тщательно промыть рот большим количеством воды. Немедленно дать выпить пострадавшему 2-3 стакана воды. При наличии симптомов отравления по завершении указанных процедур обратиться за медицинской помощью.

Попадание в глаза: Тщательно промыть глаза большим количеством воды. При необходимости обратиться за медицинской помощью.

Проливание (просыпание) материала: В случае проливания или просыпания материала надо сделать следующее:

А) при большом количестве – одеть защитную спецодежду, перчатки, очки и маску; собрать материал в соответствующий контейнер и тщательно его закупорить; утилизация материала – в соответствии с действующим законодательством; удалить остатки вещества большим количеством воды;

Б) при небольшом количестве – одеть защитные перчатки и удалить остатки вещества большим количеством воды.

БУДЬТЕ ВНИМАТЕЛЬНЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ СУХИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Некоторые из возможных ошибок при приготовлении сред

Ошибки	Причины
Отклонение рН	Перегревание, неполное перемешивание, слишком длительная стерилизация, использование щелочного стекла, неочищенной воды, повторное плавление, гидролиз ингредиентов, длительное хранение при высокой температуре
Неполное растворение	Перегревание, неполное перемешивание, слишком длительная стерилизация, использование щелочного стекла, неочищенной воды, повторное плавление, гидролиз ингредиентов, длительное хранение при высокой температуре
Потемнение	Перегревание среды, чрезмерное количество сухой среды, плохое перемешивание
Слишком мягкий гель	Агар не растворился, неполное перемешивание, отклонение от инструкции по восстановлению сухой среды, кислотный гидролиз агара, избыточное разведение агара инокулюмом
Потеря ростовых и дифференцирующих свойств	Повторное плавление, чрезмерное нагревание, неполное перемешивание, избыточное разведение среды инокулюмом, неадекватный растворитель инокулюма и др.
Ненормальный цвет среды	Непригодность сухой среды, плохо вымытая посуда, неочищенная вода
Токсичность среды для микробов	Плохо вымытая посуда, неочищенная вода, подгорание среды
Контаминациясреды микробами	Неправильная/недостаточная стерилизация, неправильная техника введения добавок и розлива среды

Хранение продуктов компании HiMedia

Для получения оптимальных результатов применения продукты компании HiMedia важно хранить при соответствующих условиях. Не следует использовать по назначению продукты с истекшим сроком годности. Условия хранения и сроки годности указаны на соответствующих этикетках, контейнерах и в инструкциях-вкладышах. Рекомендуется использовать продукты в порядке возрастания номеров серий и партий.

Отношение к свету

Желательно хранить все приготовленные питательные среды в темноте и всегда — вдали от прямых солнечных лучей.

Отношение к температуре и влажности

Ввиду гигроскопичности сухие питательные среды повреждаются во влажной атмосфере, поэтому важно не оставлять емкости с ними надолго открытыми. Высокая температура хранения или условия комнаты для приготовления питательных сред не являются подходящими для хранения контейнеров с питательными средами, особенно тех, которые часто открывают.

Рекомендуемое время и температура хранения

Сухие питательные среды (М)
Нераспечатанные сухие питательные среды при хранении в оптимальных условиях имеют срок годности 2-5 лет.

Высушенные питательные среды производства компании HiMedia поставляются в непрозрачных водоотталкивающих пластиковых флаконах с навинчивающимся колпачком, который имеет внутреннюю крышку, поэтому не требуется дополнительное укупоривание. После взятия среды крышку надо вернуть на место и тщательно зарыть ею флакон.
Невскрытые контейнеры со средами следует хранить при температуре ниже 25 °С или ниже 8 °С, если нет других указаний (см. этикетку).
При первом вскрытии флакона или другого контейнера на нем пишут дату вскрытия.

Селективные добавки (FD)
Рекомендуется хранить при +2…8 °С, срок хранения — от 1 до 3 лет.

Диски с антибиотиками (SD, OD)
Хранят при минус 20 °С, рабочие партии – при +2…8 °С. Срок хранения — от 1 до 3 лет.

Компоненты питательных сред (RM)
Невскрытые контейнеры с компонентами сред следует хранить при температуре ниже 25 °С, агар-агар – ниже 30 °С, а лошадиную сыворотку – при температуре ниже минус 20 °С.

Материалы для дифференциации микробов
Рекомендуется хранить при +2…8 °С, за исключением факторов V и X (при минус 10 °С) и дисков с углеводами (ниже 30 °С); срок хранения — от 9 мес до 2 лет.

Внешний вид этикетки флакона с сухой питательной средой

А — Название продукта	Ж — Указания по приготовлению среды
Б — Номер по каталогу	З — Рекомендуемая температура и другие условия хранения продукта
В — Размер упаковки	И — Рекомендуемая процедура утилизации
Г — Назначение продукта	К — Срок годности продукта
Д — Состав продукта	Л — Номер партии
Е — Величина рН готовой среды

Программа контроля качества

Создание питательных сред для микроорганизмов требует взвешенной оценки, как отдельного ингредиента, так и взаимодействия всех компонентов друг с другом. Осознавая это, специалисты компании HiMedia применяют соответствующие методы контроля на разных этапах производства, что позволяет получать высококачественные питательные среды. Их применение обеспечивает необходимую воспроизводимость результатов исследования.

Контроль качества отдельных компонентов

В состав сухих питательных сред входят различные компоненты:

• Пептон (источник азота);
• Углеводы (источник углерода);
• Минеральные вещества (неорганические соли, микроэлементы);
• Селективные вещества;
• Витамины;
• Красители и индикаторы pH;
• Гелеобразующий компонент.

1.Пептоны (мясной, казеиновый, соевый, желатиновый, дрожжевой и др.):
Продукты гидролиза белка, обычно называемые пептонами, представляют собой смесь полипептидов, олигопептидов, аминокислот, органических источников азота, солей и микроэлементов. Применение разных пептонов отражает различные потребности микроорганизмов в аминокислотах и пептидах. Характеристики пептона зависят от источников белка (казеин, мясо или соя) и типа гидролиза: кислотного или ферментативного (трипсин, пепсин или папаин).

Для контроля производимых пептонов, помимо собственного комплекса исследований, компания HiMedia проводит анализ согласно Фармакопее США (раздел “Peptic Digest of Animal Tissue”) на соответствие критерию “Панкреатический перевар казеина” (14).

Обычные тесты для анализа пептонов

1. Степень переваривания;
2. Потеря при 100° С;
3. Содержание азота;
4. Содержание a -аминного азота;
5. Остаток после сжигания (зольность);
6. Отсутствие нитритов;
7. Содержание солей (например, NaCl);
8. Содержание фосфатов;
9. Микроэлементы;
10. Ферментируемые углеводы;
11. Липиды;
12. Витамины;
13. Совместимость с другими ингредиентами при 121° С в течении 15 минут;
14. Оценка микробиологами:
    а) по обнаружению специфических метаболитов (индола, ацетилметилкарбинола, сероводорода);
    б) по ростовым свойствам (на жидких средах оценивают степень мутности,
    на плотных — характеристики колоний микроорганизмов по методу Miles и Misra (12)).

2. Углеводы:

В состав питательных сред обычно входят следующие углеводы:

Адонит	Инулин	Салицин
Арабиноза	Крахмал	Сахароза
Галактоза	Ксилоза	Сорбит
Гликоген	Лактоза	Трегалоза
Глицерин	Мальтоза	Фруктоза
Глюкоза	Маннит	Целлобиоза
Декстрин	Манноза	Эритрит
Дульцит	Рамноза	Эскулин
Инозит	Раффиноза

Некоторые микроорганизмы могут утилизировать широкий спектр углеводов, другие более прихотливы или утилизируют только один углевод. Последние можно идентифицировать по ферментации или окислению ими углеводов, добавленных в среду. В диагностической практике бактериологии используется большое количество питательных сред, в состав которых входят специфические углеводы и индикаторы для обнаружения особых ферментативных реакций (2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13).
Углеводы, используемые в питательных средах, проверяют на подлинность и отсутствие примесей.
Контроль осуществляют следующим образом. Готовят жидкие и плотные питательные среды с одним известным углеводом – стандартным и испытуемым. Затем проверяют способность углеводов поддерживать рост микроорганизмов. На плотных средах после посева и инкубирования сравнивают характеристики колоний на среде со стандартным углеводом и с испытуемым (по размеру, цвету, форме и реакции индикаторов).

3.Минеральные вещества и другие компоненты:

Некоторые минеральные соли необходимы для роста и метаболизма всех живых клеток. Для большинства бактерий требуется наличия в питательной среде натрия, калия, магния, марганца, двух- или трехвалентного железа в виде солей (хлоридов, фосфатов, сульфатов).

4.Селективные вещества (соли желчны кислот и бычья желчь)

Вещества, получаемые из желчи, вводят в состав питательных сред для дифференциации бактерий, адаптированных и неадаптированных к условиям обитания в кишечнике.
Для дифференциации бактерий по толерантности к желчи готовят селективные среды с повышенной концентрацией желчи и ее производных.
Химический анализ солей желчи проводится, как описано в National Formulary для дезоксихолата натрия, холата натрия и таурохолата натрия (B.P. 1949, 14 — U.S.P.).
В питательной среде эти вещества не должны оказывать влияния на первоначальный цвет индикаторной краски(ок) и его дальнейшие изменения в процессе роста микроорганизмов.
Среде при этом не должна пениться или давать осадок при хранении. Далее проводится функциональная проверка желчи, с использованием в качестве контроля стандартных желчных солей. Проводится также тест по выделению референс-штамма E. coli на средах с испытуемыми и стандартными желчными солями.
Плотные питательные среды с различными солями желчи проверяются методом поверхностной капли по Miles и Misra (12).
Для каждой среды записываются ростовые характеристики различных энтеробактерий.

5.Красители и индикаторы pH

Добавляемые в питательные среды красители используют как селективные вещества, а также в качестве индикаторов pH или окислительно-восстановительного потенциала. Их ингибирующая активность может зависеть от взаимодействия с другими компонентами среды. Так, активность бриллиантового зелёного в отношение E. coli существенно варьирует в растворах разных пептонов. С бриллиантовым зелёным взаимодействуют соли желчи, в результате чего снижается токсичность краски и это надо учитывать при введении таких красителей в среду с желчными солями. Анилиновые красители более токсичны в состоянии полной окисленности, а при их стерилизации в присутствии пептона (в составе бульона) возможно их частичное восстановление. Также при использовании агара с высоким содержанием минеральных веществ часто наблюдается несовместимость компонентов среды. В этой связи необходимо, чтобы красители, используемые для приготовления питательных сред, проходили контроль согласно “H.J.Conn’s Biological Stains”, 9^е издание, издательство Williams & Wilkins Company, Baltimore. Кроме контроля химической чистоты краситель должна быть проверен микробиологическим методом, т. е. путем посева референс-штаммов на среды с испытуемым и стандартным красителями, инкубирования и сравнения результатов посева.

6.Гелеобразователь

Основное предназначение агар-агара в питательной среде — сформировать гель определенной плотности. Важной характеристикой является также прозрачность агаровой питательной среды. В идеале, расплавленный агар должен быть кристально чистым, без признаков помутнения или осадка. Причиной помутнения является несовместимость минеральных веществ или попадание в среду мельчайших частиц (в результате неэффективной фильтрации). Другой характеристикой агара являются параметры диффузии различных химических соединений в агаровом геле. это свойство агаровых сред используется для микробиологической оценки витаминов и антибиотиков. Диффузия происходит из резервуара, расположенного в определенной точке агара. При этом вокруг резервуара образуется зона задержки роста микробов, диаметр которой прямо пропорционален активности антибиотика или зона роста, пропорциональная активности витамина.

Агар-агар для бактериологических целей должен отвечать следующим химическим параметрам:

1. Содержание золы	Не более 1,9 %
2. Кислая нерастворимая зола	Не более 0,25 %
3. Сульфаты	Не более 1 %
4. Хлориды	Не более 0,1 %
5. Кальций	Не более 0,4 %
6. Магний	Не более 0,2 %
7. Общий азот	Не более 0,25 %
8. Железо	Не более 25ґ 10-6
9. Плотность геля	Не менее 530 г/см2
10. Температура застывания	Не менее 36° С
11. Влажность	Не более 15 %
12. pH 1,2 %-го геля	До автоклавирования не более 6,1; после — не менее 5,7
13. Диффузия агарового геля	Не менее 1,2 мм/час
14. Температура плавления 1,2 %-го геля	Не более 85° С

Кроме того, проводится тест на присутствие в агаре токсичных веществ и ингибиторов роста микроорганизмов. Для этого на испытуемую питательную среду и среду со стандартным агар-агаром засевают быстро растущие микробы с последующим сравнением скорости роста, размера, формы, пигментированности колоний и т. д.

7. Витамины:

Анализ витаминов и их предшественников на химическую чистоту и по другим тестам проводится согласно Фармакопее США (14) и Пищевому Химическому Кодексу США (7).
Помимо химического анализа активность подтверждается микробиологическими методами по A.O.A.C.(3).

Контроль качества в ходе производства:

Образцы готовят из проверенных и утвержденных компонентов и анализируют параллельно с предварительно намеченной эталонной партией готовой среды.
Большая серия партий утверждается для производства после оценки всех характеристик, включая цвет, прозрачность, рН, растворимость, гелеобразование совместимость ингредиентов и культуральные характеристики образца. В процессе производства в соответствии принципами GMP (хорошей практики производства) каждой стадии уделяется самое пристальное внимание (14).
На промежуточных стадиях производства отбирают образцы и доставляют в контрольную лабораторию для микробиологической оценки по собственным критериям, разработанным компанией HiMedia. При большинстве производственных процессов постоянно контролируют такие условия, как температура, влажность и др. Производство осуществляют на оборудовании из нержавеющей стали или стекла, что позволяет предотвращать загрязнение продукции токсичными металлами.

Контроль качества готовых сред:

Окончательно готовую продукцию проверяют в сухом виде по ряду физических параметров, чтобы обеспечить однородность среды: внешний вид, цвет, запах, влажность, растворимость, прозрачность, рН, температура гелеобразования (для агаровых сред). Во избежание нестабильности характеристик от партии к партии у полученных сред в сравнении с готовой к использованию эталонной средой изучают культуральные свойства. Среда должна пройти все тесты, намеченные лабораторией контроля качества HiMedia: ростовые свойства, дифференциация, биохимические параметры, обнаружение роста при посеве минимального инокулюма, селективность и др. После прохождения этих тестов, продукция направляется в торговую сеть.

Исследование стабильности при складском хранении конечной продукции:

Образцы полностью проверенной продукции и протоколы, составленные в ходе их производства, хранятся для будущих сравнительных исследований.
Через 6 месяцев для подтверждения стабильности проводится сравнительное исследование образцов партий с использованием эталонных сред.

Литература:

1. American Public Health Association — Standard Methods for Examination of Dairy Products, 14^th edition, 1978
2. American Public Health Association — Compendium of Methods for Microbiological Examination of Food, 1976
3. Association of Official Analytical Chemists, 14^th edition, 1984
4. Clinical Bacteriology by E. Joan Stokes & G.L. Ridgway, 5^th edition, 1980
5. Cruickshank R., Duguid, J.P., Marmion , B.P. & Swain, R.H.A., 1975, Medical Microbiology, 12^th Edition, — Churchill Livingstone, Edinburg, London, New York.
6. FDA Bacteriological Analytical Manual, U.S.A., 5^th edition, 1979.
7. Food Chemical Codex, 3^rd edition, 1981.
8. Laboratory Procedures in Clinical Microbiology, 2^nd edition, 1985 by John A. Washington Published by Springer-Verlag, New York.
9. Manual of Clinical Microbiology, 4^th edition by American Society for Microbiology, Washington D.C., 1985.
10. Media for isolation-cultivation-identification & Maintenance of Medical Bacteria. Vol. I, by Jean F.MacFaddin, Williams & Wilkins. Baltimore, 1985.
11. Methods in Carbohydrate Chemistry Vol I, Academic Press, U.S.A.
12. Miles A.A. & Misra S.S. (1938) «The Examination of Bactericidal Power of Blood» J. Hyg. Camb 38, 732-748
13. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 1985, 16^th edition, APHA, AWWA, WPCF.
14. U.S. Pharmacopeia XXI National Formulary XVI, 1985.

Указания по безопасности

Обращение и использование — Прочтите надписи на этикетке перед тем, как вскрыть контейнер. — Убедитесь в том, что перед Вами тот продукт, который Вам нужен. — Помните о возможной опасности при обращении с реактивами и используйте соответствующую защитную одежду и приспособления. — Открывать контейнер следует осторожно, в хорошо проветриваемом помещении. — Соблюдайте осторожность при извлечении и применении опасных реактивов, используйте методы, уменьшающие риск отравления при вдыхании, попадании вещества внутрь, на кожу, в глаза или на одежду. — Избегайте использования загрязненных инструментов и аппаратуры. — После использования тщательно закупоривайте контейнеры. — При работе с реактивами не допускается прием пищи, питье или курение. — Тщательно промывайте загрязненные руки и одежду. — В случае проливания или просыпания реактива поступайте в соответствии с указаниями по мерам безопасности. — При воздействии реактива на организм немедленно обратитесь за медицинской помощью, оказав пострадавшему первую помощь, и наблюдайте за ним до прихода врача.

Хранение

1. В необходимых случаях температура хранения указана на этикетке. Все остальные продукты хранят при температуре ниже 30 °С.
2. Материалы следует хранить в сухом, хорошо проветриваемом месте без резких колебаний температуры, вдали от открытого огня.
3. Не допускайте к реактивам посторонних лиц.
4. Опасные вещества надо хранить отдельно.
5. Периодически необходимо проводить ревизию и удалять со склада испорченные материалы.
6. Не допускайте курения в местах, где хранятся огнеопасные реактивы.
7. Осторожно обращайтесь с контейнерами, где могут быть остатки опасных веществ. 

В процессе микробиологического исследования выделяют чистые культуры микроорганизмов, осуществляют их культивирование с последующим изучением свойств. Культуры, состоящие из микроорганизмов одного вида, называют чистыми. Их используют при проведении диагностических мероприятий в процессе выявления инфекционных заболеваний, определяя видовую и типовую принадлежность.

Культивирование микроорганизмов осуществляется с помощью специальных субстратов – питательных сред. Среды для культивирования, выращиваемые в искусственных условиях, позволяют отследить все процессы микроорганизмов – питание, дыхание и размножение.

Особенности питательных сред, используемых для культивирования

От качества питательной среды зависят результаты исследования. Для создания оптимальных условия для жизнедеятельности микробов, среды должны соответствовать определенным параметрам:

• Питательность. В их составе должны присутствовать все необходимые вещества, обеспечивающие легкую усваиваемость, а также удовлетворение потребностей в пище и энергии. В некоторых случаях в состав питательных сред специально добавляют витамины и аминокислоты, обеспечивающие необходимый рост клеток.
• Оптимальная концентрация водородных ионов. Для обеспечения необходимой проницаемости оболочки клеток.
• Изотоничность. Для поддержания осмотического давления в среде в соответствии с давлением внутри клетки.
• Стерильность. Для исключения посторонних микробов, которые могут препятствовать росту.
• Оптимальная консистенция.
• Окислительно-восстановительный потенциал.
• Унифицированность. Обеспечивает содержание постоянного количества ингредиентов.

Для удобства слежения за ростом культивируемых культур, среда должна быть прозрачной.

Питательные среды можно классифицировать по нескольким параметрам:

• Компонентный состав. По этому критерию среды делят на натуральные и синтетические. Для натуральных используют продукты животного и растительного происхождения. Для приготовления синтетических сред используют органические и неорганические соединения химически чистого типа.
• Уровень плотности. По консистенции среды делятся на жидкие, плотные и полужидкие. Для получения необходимой плотности используют агар-агар или желатин.
• Состав. По этому критерию среды делятся на простые и сложные.
• Назначение. Среды делятся на общеупотребительные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие.

Особенности состава питательных сред для культивирования

Основные компоненты любой питательной среды – соединения углерода и азота. На натуральных средах хорошо растут и развиваются многие микроорганизмы, так как они содержат большое количество необходимых ингредиентов. Но их редко используют для изучения физиологии обмена веществ, так как их состав сложен и непостоянен. Для этого удобнее и информативнее использовать синтетические среды.

Приготовление питательных сред

При приготовлении сред следует использовать строго чистую посуду, которая не содержит посторонних веществ – щелочей или окислов, а также ржавчины. Оптимально использовать эмалированные, стеклянные или алюминиевые емкости. При необходимости приготовления больших объемов сред используют специальные варочные котлы или реакторы. Перед началом приготовления посуду тщательно моют, вытирают и просушивают. Стеклянные емкости предварительно необходимо прокипятить в хлор водородной кислоте.

Важно! Посуду для приготовления питательных сред запрещено использовать для других целей.

Основные компоненты большинства питательных сред – это продукты животного и растительного происхождения. Для приготовления питательных бульонов используют мясную воду или перевары от кислотного или ферментативного гидролиза. Чаще всего используют панкреатический перевар Хоттингера, гидролизаты казеина и кормовые дрожжи. На их основе готовят различные среды.

Этапы приготовления питательных сред

Процесс приготовления питательных сред состоит из следующих этапов:

1. Варка. Может осуществляться на открытом огне, на водяной бане, с использованием автоклава или варочного котла, которые нагреваются при помощи пара.
2. Установление оптимальной величины pH. Выполняют с применением индикаторных бумажек. Прибор используемый для этой операции – потенциометр или компаратор, которые представляют собой штативы с отсеками для пробирок и набора стандартов pH. При этом в пробирках сравнивают цвета жидкостей с эталонным цветом.
3. Осветление. Эта операция проводится, если в процессе приготовления среда становится мутной или темнеет. Для осветления можно использовать белок куриного яйца, смешанный с двойной порцией воды, который предварительно тщательно перемешивают и кипятят. Иногда для этих целей используют сыворотку крови.
4. Разлив. Осуществляется в специальные пробирки, объемом 3-5 или 10 мл. Это могут быть также флаконы или колбы, специальные бутылки. Если для стерилизации сред используется температура выше 100°С, то их разливают в сухие чистые емкости. Если для стерилизации используется меньшая температура, то разлив осуществляют в стерильные емкости. Для разлива используют воронку, на конце которой есть резиновая трубка с зажимом Мора.Фильтрация. Проводят для жидких и расплавленных желатиновых сред. Для этого используют влажные фильтры на основе бумаги или материи. Агаровые среды труднее фильтровать из-за того, что их застывание происходит достаточно быстро. Вместо этого для агаровых сред чаще всего используют отстаивание, с расплавлением в автоклаве.
5. Стерилизация. Режим стерилизации выбирают с учетом указаний к рецепту и в зависимости от компонентного состава. Примерная схема стерилизации приведена в таблице.
6. Контроль. Стерильность контролируют, используя термостат. Для этого среду ставят в него на двое суток. При отсутствии при осмотре признаков роста среду считают стерильной и отправляют ее на химический контроль. Химический – следующий вид контроля, благодаря которому окончательно устанавливают pH. Его проводят в химической лаборатории. Следующий вид контроля – биологический, с помощью которого определяют питательные свойства среды.

Среды	Режим стерилизации
аппарат	температура, давление	время
Простые	Автоклав	120 °C (1 атм)	20 мин
Сложные: 1) с углеводами, молоком, желатином	Автоклав с незакрытой крышкой или аппарат Коха	100 °C (текучий пар)	30—60 мин, 3 дня подряд (дробная стерилизация)
2) белковые (сывороточные или яичные) с уплотнением	Свертыватель Коха (возможны два режима)	80—85 °C	1 ч, 3 дня подряд
95 °C	1 ч, однократно
3) белковые жидкие	Водяная баня или инактиватор	58 °C	1 ч, 3—4 дня подряд

Хранение сред осуществляется при комнатной температуре, в специально предназначенных для этого шкафах. Составы с кровью или витаминами хранят в холодильниках.

Принципы составления простых и сложных питательных сред

Нормальный рост микроорганизмов возможен только в определенной питательной среде, состоящей их конкретного набора компонентов, кроме того эти компоненты должны содержаться в особых пропорциях.

Рецепты простых сред

Изотонический раствор хлорида натрия. Готовится на основе 1 литра дистиллированной воды, смешанной с 9 граммами натрия хлорида. Смесь фильтруют, и устанавливают требуемый pH, после чего при необходимости стерилизуют при температуре 120°С в течение получаса.

Мясопептонный бульон. Мясную воду смешивают с 1% пептона и 0,5% х.ч. натрия хлорида. Далее осуществляют кипячение на медленном огне в течение 10-15 минут до полного растворения ингредиентов. Далее устанавливают требуемый pH, после чего повторно кипятят до момента выпадения осадка. После проведения фильтрации объем дополняют до первоначального и проводят стерилизацию при 120°С в течение 20 минут.

Бульон Хоттинтера. Для приготовления используют перевар Хоттингера, который разводят водой в 5-6 раз с учетом содержания аминного азота. В разведенный перевар добавляют 0,5% натрия хлорида, с последующим кипячении на слабом огне до полного растворения соли. Нужный pH устанавливают в уже остывшей среде, после чего проводят фильтрацию, разлив и стерилизацию в течение 20 минут.

Мясопептонный агар. В готовый бульон (на этапе до или после стерилизации) доливают 2-3% агар-агар с последующим кипячением. Готовят состав на слабом огне с постоянным помешиванием, пока агар полностью не растворится. Для приготовления можно использовать автоклав или аппарат Коха. При необходимости готовую среду можно осветлять, фильтровать или стерилизовать.

В полужидком агаре 0,4-0,5 % агар-агара.

Питательный желатин. Для приготовления используют готовый бульон, в который добавляют 10-15 % желатина. Смесь подогревают, но не кипятят, доводя желатин до полного расплавления, после чего жидкость разливают по стерильным емкостям и проводят стерилизацию с использованием текучего пара.

Рецепты сложных сред

Среды с углеводами. Основной бульон или расплавленный агар дополняют нужным количеством определенного углевода (около 0,1-2%). После того, как он полностью растворился, состав наливают в стерильную посуду и проводят стерилизацию текучим паром. После проведения контроля стерильности среду можно использовать для культивации.

Среды с кровью. Для их приготовления используют простые стерильные среды, в которые в асептических условиях добавлена дефибринированная кровь (до 30%). Среды на основе агара перед добавлением расплавляют и остужают до 45 градусов Цельсия.

Важно! Запрещено растапливать среды с кровью, во избежание изменения свойств состава.

Среды с сывороткой крови. Готовят также, как и предыдущие составы. В основную среду добавляют от 10 до 20% сыворотки без консервантов, которая предварительно инактивирована.

Среды с желчью. В состав простых сред добавляют желчь (10-40% от объема). После устанавливают нужный pH, проводят стерилизацию при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 20 минут.

Сухие среды

Выпускают также сухие среды, которые представляют собой порошки в флаконах. На их этикетках указываются правила приготовления составов. Это могут быть как простые, так и специальные среды, а также элективные и дифференциально-диагностические. Удобство сухих составов состоит в том, что они просты в приготовлении и могут использоваться даже в походных условиях. Они могут быть приготовлены из заменителей мяса.

Внимание! Компания Медика Групп занимается продажей автоматических микробиологических анализаторов и флаконов с питательными средами, но не оказывает услуги по сбору или расшифровке результатов анализов крови.

Поделиться ссылкой: