Ошибки гематологических исследований

Ошибки гематологических исследований

Введение

Постоянно циркулируя в замкнутой системе кровообращения, кровь объединяет работу всех систем организма и поддерживает многие физиологические показатели внутренней среды организма на определенном, оптимальном для осуществления обменных процессов уровне. На основе циркуляции форменных элементов и составных веществ плазмы кровь выполняет в организме разносторонние жизненно важные функции: дыхательную, трофическую, защитную, регуляторную, выделительную и другие. Конкретное понимание многочисленных функций крови возможно лишь на основе изучения строения и свойств ее основных компонентов форменных элементов и плазмы.

Соблюдение всех методик и руководств по забору венозной и капиллярной крови влияет на точность выдаваемого результата. Снижение до минимума возможных ошибок и обеспечение высокого качества гематологических исследований возможно при стандартизации преаналитического и аналитического этапов работы.

1. Этапы лабораторного анализа

Продукция медицинской лаборатории — авторизованный отчёт, содержащий результаты лабораторного исследования, а также данные о пациенте (имя, возраст, пол, диагноз), вид биологической пробы, время её взятия и доставки в лабораторию, актуальные референсные интервалы для каждого аналита и другую информацию. Иными словами, лаборатория производит и поставляет клиницисту в той или иной степени достоверную, чаще объективную диагностическую информацию.

Цикл производства этого продукта принято разделять на три основных этапа:

·преаналитический

Назначение анализа.

Подготовка пациента.

Взятие биологического материала с использованием антикоагулянтов.

Идентификация проб.

Транспортировка проб.

·аналитический

Аналитическое исследование на гематологическом анализаторе.

Оформление бланка с результатами теста (может выполняться на самом анализаторе).

Оценка результата по интервалам норм.

Использование результатов в диагностическом процессе.

Качество результатов исследования крови на гематологических анализаторах определяется следующими факторами:

качеством используемых реагентов.

точностью дозирования цельной или разведённой крови;

точностью дозирования изотонического раствора при разведении крови;

точностью определения объёма суспензии клеток, пропущенной через апертуру;

точностью самого подсчёта клеток;

точностью определения размеров клеток;

корректностью математических методов обработки первичных результатов измерения.

·постаналитический — интерпретация результатов, диагноз и лечение пациента.

Если аналитический этап полностью проходит в лаборатории, то два других этапа имеют довольно основательную внелабораторную составляющую. И эта их особенность значительно затрудняет проведение согласованных, последовательных мероприятий по обеспечению качества.

1.1 Организация и обеспечение качества на преаналитическом этапе

Основа обеспечения качества на преаналитическом этапе — разработка и чёткое соблюдение инструкции по качеству проведения этой стадии лабораторного исследования, а также максимальная стандартизация всех основных моментов.

Подготовка пациента к исследованиям — одна из важных составляющих внелабораторной части этапа. Врач должен обязательно объяснить пациенту необходимость лабораторных исследований и информировать пациента о том, как ему нужно подготовиться к исследованиям.

При обращении в лабораторию пациентам сообщаются условия правильной подготовки к сдаче анализа. В доступных местах вывешены графики проведения анализов, а также буклеты с информацией о проводимых исследованиях. Качественное взятие материала является одним из стандартизирующих и предопределяющих моментов всего лабораторного исследования.

При регистрации данных пациента в лаборатории используют современную лабораторную информационную систему (LIS). LIS обеспечивает надёжную регистрацию, хранение и быстрый поиск результатов исследований. При регистрации данных в лаборатории используют штрих-кодирование. Штрих-код считывается специальным сканером, и заявленные аналиты автоматически переносятся в лабораторную информационную систему.

Транспортировка. Особое значение имеет стандартизация процесса транспортировки проб в лабораторию. При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с неблагоприятными условиями транспортировки. Воздействие механических факторов (тряска, вибрация, перемешивание и т.д.), нарушения температурного режима, вероятность пролива и загрязнения проб могут оказывать влияние на качество анализов. Для устранения этих причин при перевозках пробирок с кровью рекомендуется использовать герметично закрытые пластиковые пробирки и специальные транспортные изотермические контейнеры.

Основная форма контроля преаналитического этапа — периодические внешние и внутренние инспекционные проверки (аудит).

1.2 Организация и обеспечение качества на аналитическом этапе

В отличие от пре- и постаналитического этапов, где основными формами контроля служат периодические инспекционные проверки (внешние и внутренние), контроль качества аналитического этапа — это, прежде всего, оценка результатов измерений контрольных образцов.

Выделяют внутрилабораторный контроль качества и внешнюю оценку качества исследований. Под внутрилабораторным контролем качества понимают проверку результатов измерений каждого аналита в каждой аналитической серии, осуществляемую ежедневно непосредственно в лаборатории путём использования принятых алгоритмов оценки измерений контрольных материалов, преимущественно с целью оценить их воспроизводимость (близость результатов измерений одной и той же величины, полученных в разное время).

Цель внутрилабораторного контроля — выявление и устранение недопустимых отклонений от стабильного выполнения теста в лаборатории, т. е. выявление и устранение недопустимых аналитических ошибок.

Контрольный материал — однородный стабильный материал, результаты исследования которого используют для оценки погрешности выполняемых аналитических измерений. Один из основных принципов выбора контрольного материала — при использовании реактивов и калибраторов одного производителя рекомендуется применять аттестованные контрольные материалы другого производителя. Для систематического оперативного слежения за стабильностью аналитической системы по результатам исследования контрольных проб используются контрольные карты (карты Levey-Jennings). Контрольная карта графическое изображение полученных в установочной серии статистических характеристик вариаций аналитической системы, соответствующих требованиям к её точности. Оперативный контроль качества результатов измерения аналита в пробах пациентов осуществляют путём измерения этого аналита в контрольных материалах в каждой аналитической серии и нанесении полученных результатов на контрольные карты. Выявление и устранение отклонений от стабильного выполнения теста в лаборатории является целью внутрилабораторного контроля качества. Контрольные карты строятся для каждого аналита и для каждого уровня контрольного материала, предназначенного для оперативного контроля качества. Целью внешней оценки качества исследований является оценка соответствия результатов исследований установленным нормам аналитической точности. Внешняя оценка качества — объективная проверка результатов лаборатории, осуществляемая периодически внешней организацией. Любая хорошо организованная система внешней оценки качества предназначена для сопоставления результатов анализов между лабораториями с целью гармонизации результатов лабораторных исследований.

1.2.1 Возможные ошибки лабораторных исследований крови

Лабораторный этап обработки проб крови вносит свой вклад в погрешность результатов, которые можно разделить на три вида: случайные, систематические и грубые.

Случайными называются неопределенные по величине и знаку ошибки, в появлении которых не наблюдается закономерности. Случайные ошибки сопутствуют любому измерению, как бы тщательно оно не проводилось, и проявляются в некотором различии результатов измерения одного и того же элемента, выполненного данным методом. Эти развития обусловлены колебаниями:

) свойств пробы — негомогенность, неравномерность перемешивания;

) точности измерительного инструмента — пипеток, мерной посуды, термо- и фотометрических приборов, счетных камер;

) точности работы персонала лаборатории — неточное пипетирование или считывание результатов, ошибка утомления, неверный подбор класса точности инструментов, психологическая ошибка, например, оказание предпочтения каким-либо цифрам и т.д.

Величина случайной ошибки характеризует воспроизводимость результатов исследований.

К систематическим ошибкам относятся погрешности, происходящие от определенных причин. Одинаковые по знаку, они либо увеличивают, либо уменьшают истинные результаты. После выяснения причины, вызывающей систематическую ошибку, ее можно устранить или ввести поправочный коэффициент.

Причиной систематических ошибок являются:

методические ошибки, обусловленные возможностью метода анализа; наиболее серьезная, и трудно устранимая причина искажений результатов;

ошибки, зависящие от применяемых приборов и реактивов, определяются точностью приборов, загрязнением реактивов продуктами разрушения тары, взаимодействием с воздушной средой и испарениями других реактивов и др.;

ошибки оперативные, происходящие от неправильного или неточного выполнения операции, например, изменение времени окрашивания, неправильное выливание растворов из пипеток;

ошибки индивидуальные, зависящие от личных способностей оператора, его органов чувств, привычек.

Величина систематической ошибки влияет на всю серию определений и характеризует правильность результатов анализа.

Грубыми ошибками называют полученные одиночные значения анализируемого параметра, выходящие за пределы допустимой величины погрешностей. Причиной грубых ошибок может стать неправильная доза препарата, ошибки в расчетах, небрежность или недостаточная тщательность в работе. Необходимо отличать грубые ошибки от показателей, характеризующих резкие изменения исследуемых параметров; последние проверяются повторными или параллельными анализами.

Среди способов выявления случайных ошибок в лабораторной практике применяют анализ двух (или нескольких) параллельных проб а также последовательное проведение анализов повторно у одного и того же животного. Расхождение результатов свидетельствует об ошибке.

Если все или большинство результатов, полученных в течение дня, отличается от обычных значений возможно присутствие систематической ошибки. В поисках ее причин полезным подспорьем являются записи в лабораторном журнале, анализ которых позволяет выявить значение новой партии реактива, составление нового калибровочного графика или реактива, отключение для профилактики холодильника или термостата, замена ламп в фотометре и т.д. Использование автоматических устройств для анализа ведет к сокращению числа случайных ошибок, но увеличивает необходимость контроля за систематическими погрешностями.

Таким образом, высокая точность измерений, отражающая близость их результатов к истинному значению измеряемой величины, соответствует малым значениям ошибок всех видов и обеспечивается наряду с контролем всех элементов клинико-диагностических исследований унификацией и стандартизацией методов анализа

Основными источниками ошибок при подсчете эритроцитов являются:

Неточное взятие крови в пипетку.

Образование сгустка, поглощающего часть клеток и занижающего результат

исследования.

Недостаточное перемешивание содержимого пробирки перед заполнением камеры.

Неправильная подготовка камеры: недостаточное притирание покровных стекол;

неравномерное заполнение камеры, образование пузырьков воздуха.

Подсчет эритроцитов сразу после заполнения камеры, не выжидая 1 минуту.

Подсчет меньшего, чем требуется по методике, количества квадратов.

Плохо вымытые камера, пробирки, пипетка, капилляр для взятия крови;

недостаточно просушенные пробирки и пипетки.

Использование недоброкачественного разводящего раствора.

Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:

Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к занижению результата).

Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.

Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов, камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.

Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева.

Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа.

1.3 Организация и обеспечение качества на постаналитическом этапе

Как и преаналитический этап, этот этап можно разделить на внутрилабораторную и внелабораторную части. Основной элемент внутрилабораторной части постаналитического этапа проверка квалифицированным лабораторным специалистом результата анализа на предмет его аналитической достоверности, биологической вероятности или правдоподобия, а также сопоставления каждого результата с референсными интервалами. На этапе проверки результатов исследований важно учитывать факторы, препятствующие определению аналита (такие как гемолиз, липемия, избыточная желтушность, парапротеинемия и др) и являющиеся критериями отказа. Степень влияния этих факторов часто зависит от метода измерения аналита, поэтому на преаналитической стадии сомнительная проба может быть принята на исследование. Форматированию бланков отчёта уделяют особое внимание: используется группировка результатов по патофизиологическому принципу с указанием референсных значений, что значительно упрощает трактовку результатов. Эта часть этапа заканчивается подписью (авторизацией) бланка отчёта, т. е. формированием конечного продукта лабораторного процесса и передачей его клиницисту.

Внелабораторная часть — это, прежде всего, оценка лечащим врачом клинической значимости информации о состоянии пациента, полученной в результате лабораторного исследования. Авторизованный отчёт с результатами лабораторных исследований поступает клиницисту, который интерпретирует полученную лабораторную информацию, сопоставляет её с данными собственного наблюдения за пациентом и результатами других видов исследований и использует её для оказания пациенту медицинской помощи.

Как и для преаналитического этапа, основная форма контроля качества проведения постаналитического этапа — это периодические внешние и внутренние проверки (аудит).

2. Автоматические методы анализа клеток крови

Гемограммой называют профиль исследований, состоящий из определения количества лейкоцитов, эритроцитов, гематокритной величины и концентрации гемоглобина. Автоматизация в гематологии предлагает новый подход к дифференцированию лейкоцитов. В большинстве случаев отклонения лейкоцитарной формулы от нормального распределения требуют дополнительного исследования мазка крови под микроскопом. На основе анализа тысяч клеток гематологические анализаторы способны представлять данные в виде гистограмм — распределений клеток по размерам. Большинство анализаторов представляет в виде гистограмм распределение по размерам тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов.

Все многообразие гематологических приборов можно разделить на 3 класса с учетом их технической характеристики.

класс — полуавтоматические счетчики клеток крови определяющие обычно от 4 до 10 параметров (лейкоциты, эритроциты, гемоглобин, гематокрит, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроцитарной массе, тромбоциты, средний объем тромбоцита). Данные приборы в большинстве своем используют в работе предварительно разведенную кровь, поэтому комплектуются дилютерами. В основе подсчета и анализа клеток в счетчиках лежит кондуктометрический метод.

класс — автоматические анализаторы, проводящие анализ цельной крови и определяющие до 20 параметров, включая расчетные показатели красной крови и тромбоцитов по объему, а так же проводящие частичную дифференцировку лейкоцитов по 3 параметрам (гранулоциты, лимфоциты и «средние клетки», состоящие преимущественно из эозинофилов и базофилов). В основе подсчета и дифференцировки клеток в анализаторах данного класса лежит кондуктометрический метод, который дополняется системами внутреннего контроля качества, волюметрического контроля и т.д.

класс — высокотехнологические гематологические анализаторы, позволяющие проводить развернутый анализ крови, включая полную дифференцировку лейкоцитов по 5 параметрам (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты), гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, скетограммы. В основе работы приборов этого класса лежит комбинация кондуктометрического метода с другими методами (рассеяние лазерного луча, радиочастотный, цитохимический, использование различный дифференцирующих лизатов и т.д.).

Работа с гематологическими анализаторами требует предельной аккуратности и точности, строгого соблюдения требований соответствующих инструкций к прибору. Большинство ошибок и неточностей при работе с гематологическим анализаторами связано с техническими погрешностями: низкое качество разводящих жидкостей, погрешности при заборе крови, грязная посуда, удлинение интервала времени между забором крови или приготовлением разведений и подсчетом клеток и т.п. Однако существует категория ошибок, связанных с особенностью патологических образцов крови.

Концентрация гемоглобина (HGB).

В большинстве гематологических анализаторов для определения концентрации гемоглобина используется цианметгемоглобиновый колориметрический или спектрофотометрический метод.

Причины возможных ошибок при определении концентрации гемоглобина:

Ø Технические ошибки: нарушение правил забора крови, нарушение инструкции к анализатору, попадание в пробу моющих средств, остатков спирта с пальца пациента, низкое качество реактивов и т.д.

Ø Связанные с особенностями исследуемой крови при патологи (завышение результатов анализа): высокий лейкоцитоз (>30·109/л), парапротеинемия (преципитация патологических иммуноглобулинов), агглютинация эритроцитов при парапротеинемиях, аутоиммцнных процессах, уремия (при гиперосмолярности плазмы нарушается лизис эритроцитов), гиперлипопроитеинемия, гипербилирубинемия, внутрисосудистый гемолиз.

Количество эритроцитов в единице объема крови (RBC).

Количество гематологическими анализаторами определяется кондуктометрическим методом.

Причины ошибок при подсчете эритроцитов следующие:

Ø Технические (см. HGB)

Ø Связанные с особенностями исследуемой крови (внутрисосудистый гемолиз эритроцитов, агглютинация эритроцитов, наличие большого числа микро- и шизоцитов (эти элементы паодсчитываются ангализатором как тромбоциты)

Ø Высокий лимфоцитоз (>50·109/л) с преобладанием малых лимфоцитов.

Количество лейкоцитов (WBC).

Увеличение или снижение количества лейкоцитов интерпретируется соответственно клиническому случаю (лейкоцитозы, лейкопении, лейкемоидные реакции и др.) параллельно с анализом изменений в лейкоцитарной формуле.

Причины ошибок при подсчете лейкоцитов:

Ø Технические (см. HGB)

Ø Связанные с особенностями исследуемой крови

Ø Наличие аутоантител к лейкоцитам, формирование агглютинатов лейкоцитов, которые прибор считает как одну клетку

Ø Наличия хрупких, легко разрушающихся клеток при лейкозах, тяжелых интоксикациях

В большинстве гематологических анализаторов используется кондуктометрический метод, позволяющий дифференцировать лейкоциты в зависимости от их объема. Результаты исследования отражены в лейкоцитарных гистограммах и цифровом выражении относительного и абсолютного количества различных форм лейкоцитов. В зависимости от категории прибора подсчитывается количество одного, двух, трех и более видов лейкоцитов.

Точная дифференцировка лейкоцитов на отдельные популяции, выявление тонких морфологических изменений в клетках возможны только с помощью микроскопического исследования окрашенного мазка крови. Дифференцированный подсчет лейкоцитов гематологическим анализатором — это скрининг, при котором все патологические результаты подлежат последующему микроскопическому исследованию.

Количество тромбоцитов (PLT).

Число тромбоцитов в автоматических счетчиках определяется прямым кондуктометрическим методом. Подсчитываются частицы объемом 2-30 фл.

Ошибки при определении количества тромбоцитов:

Ø Технические: неправильное взятие крови (трудности в нахождении вены, венозный застой, повреждение эндотелия и др.) способствуют агрегации тромбоцитов, образованию микросгустков.

Ø Ошибки, связанные с особенностями исследуемой крови (наличие антител к тромбоцитам, в результате чего наступает агрегация тромбоцитов, прилипание тромбоцитов к лейкоцитам (сателлитизм) при больших лейкоцитозах).

Ø Завышение количества тромбоцитов отмечается при большом количестве микроцитов и шизоцитов.

3. Особенности влияния различных факторов на результаты исследования крови

Изменения клеточного состава периферической крови наблюдается как при патологии, так и в различных физиологических состояниях организма. На показатели крови могут оказывать влияние физическая и эмоциональная нагрузка, сезонные, климатические, метеорологические условия, время суток, прием пищи, курение и т. д. Так при интерпретации результатов необходимо учитывать такие данные, как возраст, пол, активность пациента и положение его тела в момент взятие крови.

С точки зрения физиологии, «нормальными» величинами лабораторных показателей считают значения, определенные у тщательно обследованных групп пациентов среднего возраста без объективных признаков патологии. Показатели, нормальные для группы одного возраста, пола, условий обитания, режима использования и т.д. отражают влияние межиндивидуальных колебаний исследуемых величин и определяют нормативы.

Клеточные и химический состав крови не является постоянным, поскольку отражает количественные и качественный изменения, происходящие при непрерывной смене физиологических процессов в организме: смена физической активности и покоя, приема пищи. Смена сна и бодрствования, влияние биологических ритмов. Эти факторы влияют на индивидуальные колебания показателей крови и соответствуют форме и степени реактивности организма каждого пациента.

Регулярные изменения состава крови наблюдаются в течение суток — суточные ритмы. Хорошо изучены суточные колебания содержания электролитов, стероидов, фосфатов, липидов, сахара, холестерина, кортизола и некоторых других показателей. Для ограничения влияния суточных вариаций на результаты анализа необходимо всегда брать пробы в одно и тоже время дня.

Чрезмерное возбуждение пациента во время фиксации и взятии крови может приводить к изменению показателей кислотно-щелочного равновесия, сахара, многих гормонов, количества эозинофилов и лимфоцитов. Значительные сдвиги активности ферментов связаны с физической нагрузкой. В зависимости от положения тела в пространстве варьируют показатели белка, кальция, калия, альбумина, аспартатаминотрансферазы, кислой и щелочной фосфатаз, фосфора и холестерина.

Еще более возрастает роль лечебных мероприятий, располагающих арсеналом средств интенсивного воздействия физических (тепловые процедуры, разряды тока, ультрафиолетовое облучение, воздействие УВЧ), химических (лекарственные препараты), или биологических (сыворотки, вакцины, аутогематерапия) факторов. Особым фактором воздействия является оперативное вмешательство, которое, как и любая травма приводит к закономерным неспецифическим изменениям метаболизма, носящим циклический характер.

Большинство современных лечебных средств влияет на результаты лабораторных исследований за счет либо фармакологической (в организме), либо технологической (при анализе пробы) интерференции. К механизмам фармакологической интерференции, или, говоря иначе, наложению изменений за счет лекарственных веществ на показатели данного состояния организма можно отнести:

а) изменение интенсивности патологического процесса;

б) побочное действие на деятельность различных органов и систем;

в) общий токсический эффект при передозировке или кумуляция;

Технологическая интерференция лекарства или его метаболитов проявляется во время лабораторного исследования, т.е. ее можно воспроизвести, добавляя определенное вещество к пробе сыворотки крови. Влияние технологической интерференции может носить физический, химический или биологический характер, когда, например, она оказывает воздействие на клеточный состав крови.

4. Информативность и достоверность гематологических тестов

С диагностической точки зрения предметом исследования крови для получения информации о состоянии организма служат:

а) структурные характеристики — форма и строение клеток, наличие химических соединений определенной структуры;

б) количественные характеристики — размеры и соотношения структурных компонентов клеток, число определенных клеточных элементов, их соотношение, концентрация химических соединений;

в) функциональные характеристики — осуществления цикла развития и созревания клеток, кругооборота и превращения химических веществ.

Для определения достоверности полученных результатов лабораторных исследований они должны быть выражены в цифровой форме, по меньшей мере в двоичной системе ответов -да, нет-, используемой в качественной оценке проб. Однако в гематологии все еще значительное распространение имеют словесные формы описания формы, цвета, плотности и гомогенности окраски клеток и их компонентов, соотношения их размеров. С развитием и совершенствованием методов исследования, использования цитометрических и цитофотометрических устройств объективность подученных результатов возрастает.

Использование лабораторных показателей для выявления патологии состоит в обнаружении отличия между показателями крови исследуемого и их значениями в норме. При этом необходимо учитывать величину изменчивости биологических систем и колеблемость их параметров в границах гомеостаза в ответ на внешние и внутренние факторы воздействия.

Данные лабораторного исследования являются случайной величиной, так как подвержены влиянию следующих факторов:

) биологических, определяющих биологическую вариацию результатов лабораторных исследований в пределах нормальных величин;

) диагностических и лечебных мероприятий, проводимых обследуемому, включая реакцию животного на фиксацию, манипуляции иди присутствие исследователя;

) условия взятия, хранения и транспортировки биологической пробы, влияние консервантов и антикоагулянтов — доаналитическая вариация;

) условия лабораторного анализа: ошибки метода, реактивов, приборов, лаборантов — аналитическая вариация;

) патологических, определяющих отклонения результатов гематологических исследований за пределы нормальных величин — патологическая вариация.

Как случайные величины результаты лабораторных исследований крови образуют вариационный ряд с характерным для него расположением большинства величин вблизи его центральной части и рассеиванием к краям ряда, создавая определенное распределение, В связи с тем, что очень многие эмпирические распределения биологических признаков, характеризующихся непрерывной вариацией, приближаются к нормальному распределению, этот вид распределения занимает важнейшее место в биологической статистике.

При многократном повторном исследовании, когда имеют место в основном аналитические факторы вариации (см. условие 4.), результаты анализов обычно подчиняются закону нормального распределения. Биологические данные, то есть признаки в популяции здоровых и больных, испытывающие влияние биологических факторов вариации, могут не подчиняться закону нормального распределения. В таком случае для статической обработки результатов может быть уместным их преобразование в логарифмы и получении логарифмического нормального распределения.

гематологический тест кровь клетка

Для подсчета и анализа клеток крови используют ручные микроскопические методы и гематологические счетчики разного уровня автоматизации. В настоящее время необходимо внедрение технологий автоматического изучения клеточного состава крови, для того чтобы добиться высокого качества и точности исследований, исключая ошибки, зависящие от работы лаборантов. Клинические лаборатории нуждаются в разработке новых более совершенных методов. За последние 15 лет произошло существенное развитие технологий и аппаратуры для автоматического исследования клеток.

В некоторых странах мира автоматический анализ крови почти полностью заменил ручные и полуавтоматические.

Список используемой литературы

1. Александровская О.В., Радостина Т.Н., Козлов Н.А. Цитология, гистология и эмбриология. — М: Агропромиздат, 1987 — 448 с.

. Грин Н. , Стаут У., Тейлор Д. Биология. — М: Мир, 1990. — Т. 3, №2. — С. 193 с.

. Клиническая лабораторная аналитика //под ред. Меньшикова В.В. — М: 1999. — т 2.

. Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долглов В.В. Лабораторная гематология. — М: Юнимед-пресс, 2002. — 115 с.

. Луговская С.А. Лабораторная гематология. — М: Лаборатория, 2001 — № 2 2 3 с.

6. Луговская С.А. и др. Лабораторная диагностика. С.А. Луговская [Морозова В.Т.,]. — М.: Юнимед-пресс, 2002

. Медицинские лабораторные технологии (в 2 томах). Том 1. под редакцией А.И. Карпищенко.

. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. / Г.И. Назаренко [Кишкун А.А.]. — М.: Медицина, 2006.

. Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики / А.А. Кишкун. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.

. Козинц Т.И., Макарова В.А. Исследование системы крови в клинической практике Т.И. Козинц [Макарова В.А.]. — М.: Триада-Х, 1998.

ПРИЛОЖЕНИЕ

НОРМЫ (РЕФЕРЕНТНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ) ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

Эритроциты:женщины3,8-4,5 * 1012/лмужчины4,5-5,0 * 1012/лГемоглобин:женщины120,0-140,0 г/лмужчины130,0-160,0 г/лЦветовой показатель0,9-1,1Гематокрит:женщины0,36-0,42 л/лмужчины0,40-0,52 л/лноворожденные0,54-0,68 л/лЛейкоциты(4,0-9,0) * 109/лПалочкоядерные нейтрофилы:%1-6абс. величина(0,004-0,300) * 109/лСегментоядерныс неитрофилы:%47-72абс. величина(2,0-5.5) * 109/лЭозинофилы:%0,5-5,0абс. величина(0,02-0.3) * 109/лБазофилы:%0-1абс. величина(0-0,065) * 109/лМоноциты:%3-11абс. неличина(0,09-0,60) * 109/лЛимфоциты:%19-37абс.(1,2-3,0) * 109/лСОЭ:женщины2-15 мм/чмужчины1-10 мм/чТромбоциты(180,0-320,0) * 109/лРетикулоциты0,80-1.00%Мислокариоциты(45.0-250,0) * 109/лМегакариоциты(0,020-0,100) * 109/лСредний диаметр эритроцитов7,2-7.5 мкм

   Лабораторная практика традиционно делится на три этапа: преаналитический, аналитический и постаналитический. 

     Преаналитическая фаза включает в себя правильный отбор образцов, предоставление информации о пациенте, сбор и маркировку образцов, обработку образцов, сортировку, титрование и центрифугирование. Любой из этих шагов может быть пропущен, что приведет к неточным результатам, которые приписываются преаналитической фазе.

      Преаналитические ошибки при исследовани общего анализа крови чаще всего вызваны неверным пониманием запроса на анализ, неправильной маркировкой, контаминацией места отбора, гемолизом, сгустками, недостаточным количеством образцов, проблемами хранения и несоответствующей пропорцией крови к антикоагулянту или неправильным выбором антикоагулянта.

   Общая частота неточностей в лабораторных работах, согласно G. Lippi et.al. (2010), варьируется от 0,1% до 3,0%.  Считается, что преаналитические ошибки составляют от 46% до 68,2% ошибочных диагнозов, в то время как аналитические ошибки, которые были в центре внимания более ранних исследований, составляют лишь около 10% всех ошибочных диагнозов (Hammerling J., 2013). Кроме того, преаналитические ошибки составляют от 18,5% до 47% всех лабораторных ошибок. 

    Наиболее распространенными преаналитическими ошибками являются отсутствие медицинской информации, неподходящие контейнеры и потерянные образцы.

   Несмотря на то, что существуют международные стандарты отбора проб крови и стандартизации процесса тестирования, соблюдение руководящих принципов здесь крайне низкое, особенно тогда, когда лабораторный персонал не привлекается, а медсестры или врачи выполняют забор крови, частота преаналитических ошибок становится очень высокой. 

   Кроме того, критерии отбраковки образцов различаются в разных лабораториях.  Не хватает профессиональных данных по отчетности, анализу первопричин и стратегиям предотвращения лабораторных ошибок (Lima-Oliveira G, et.al., 2012).

   Наиболее распространенной преаналитической ошибкой являются изменения условий хранения из-за задержки при транспортировке, на которые приходится 19,45%, за которыми следуют пробы, забракованные из-за неверных медицинских записей- 19,16%. Общее количество забракованных разбавленных проб составляет 16,35%, а количество забракованных проб из-за неправильных пробирок составляет 16,01%). Отклоняется гемолизированных образцов — 15,13%. Немеченые образцы отклоняются в количестве 10,01%, а образцы со сгустками составляют 3,88% от общего числа забракованных образцов (Toor N., et. al., 2023)

    Низкая удовлетворенность пациентов напрямую связана с лабораторными ошибками и высокими затратами как для пациентов, так и для системы лабораторных услуг. 

    Негативное влияние лабораторных ошибок на лечение пациентов не ограничивается тем фактом, что они увеличивают время обработки, требуют дополнительных заборов крови и приводят к неточным диагнозам и неподходящим лекарствам; они также наносят ущерб репутации лаборатории и подрывают доверие пациентов к диагностическим услугам. Было подсчитано, что лабораторная ошибка оказывает негативное влияние на результаты лечения пациентов до 24,4% (Lippi G., et.al., 2006).

     Этот процесс приводит к увеличению финансовой нагрузки на систему здравоохранения. Согласно исследованию S. Green (2013), расходы на преаналитические ошибки составляют от 0,23% до 1,2% всего операционного бюджета больниц.  

Сбор крови

       Количество и концентрация дикалийэтилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) в пробирке для сбора крови требуют, чтобы кровь собиралась до определенной отметки на пробирке. Если собрано слишком мало крови, разбавление образца может привести и к изменению параметров. Относительный избыток EDTA в таких случаях также влияет на морфологию клеток крови. 

Транспортировка крови

     Транспортировка образца должна исключать высокую температуру. Фрагментация эритроцитов при этом является признаком избыточного тепла. Ложно высокое количество лейкоцитов (WBC) при высокой температуре встречается чаще, чем ложно низкое. Известно, что в определенных ситуациях гематологические анализаторы обеспечивают ложное PLT, когда истинное количество тромбоцитов является адекватным. 

Физиологические и физические факторы, влияющие на показатели общего анализа крови

      Несколько физиологических и физических факторов могут повлиять на результаты CBC и затруднить установление референтных значений. Физиологические факторы включают возраст, этническую принадлежность, пол, сезон, время суток, питание, болезни, стресс, травмы др.

    К важным физическим факторам относятся место забора крови, наличие и тип антикоагулянта, а также обработка и подготовка образцов (Dyer D.Cervasio S.,2008). Любая интерпретация результатов должна учитывать эти факторы.

Преаналитические ошибки результатов общего анализа крови

Потеря образца

Отсутствие полноценного запроса на анализ

Неправильная маркировка (19,16% преаналитических ошибок)

Сбор крови

Контаминация места, в котором производится забор крови

Недостаточное количество образца крови

Неправильный выбор антикоагулянта, относительный избыток или дефицит EDTA (16,45% преаналитических ошибок)

Неправильные пробирки (16,01%)

Гемолиз in vitro (15,13% преаналитических ошибок)

Наличие сгустков крови (3,88% преаналитических ошибок)

Транспортировка

Задержка транспортировки (19, 45% преаналитических ошибок)

Неподходящие контейнеры

Высокая температура окружающей среды при транспортировке

<RBC (фрагментация эритроцитов)

WBC >

Неправильное хранение

Высокая температура окружающей среды при хранении

<RBC (фрагментация эритроцитов)

WBC >

Первоначальное замораживание с последующим охлаждением

Нарушение срока хранения образца крови при определенной температуре

Хранение крови

    Отложенный анализ проб по организационным, техническим причинам или проверке сомнительных результатов, которые необходимо уточнить — не редкость в клинической практике. Кроме того, реорганизация лабораторных служб по всему миру влечет за собой объединение небольших лабораторий в более крупные, что особенно важно в эпоху новых инициатив в области общественного здравоохранения. Большое количество образцов отправляется из периферийных центров в централизованную лабораторию на большие расстояния, тем самым происходит задержка на 12-24 часа или даже более. Более того, в выходные дни этот интервал может превышать 36 часов.  Это важно уситывать в связи с тем, что CBC является наиболее часто проводимым лабораторным тестом, дающим основную и ценную информацию не только для облегчения диагностики и направления дальнейшего тестирования, но и для мониторинга состояния пациента, включая оценку эффективности терапии.

   В большинстве случаев мы не можем сразу провести анализ, поэтому информацией о том, как долго мы можем хранить образцы для получения надежных результатов, должны владеть как сотрудники лаборатории, так и врачи. 

    В литературе большинства производителей автоматических анализаторов часто упоминается, что образцы крови, хранящиеся либо при комнатной температуре, либо при 4 ± 2°C (в холодильнике) до 24 часов, как правило, дают надежные результаты для общего анализа крови и автоматизированного дифференциального подсчета лейкоцитов. Однако, хранение при комнатной температуре может вызвать изменения этилендиаминтетраацетата (EDTA) и количественное влияние хранения на кровь, поскольку известно, что клеточные элементы обладают ограниченной стабильностью в EDTA. В то же время, было отмечено, что хранение в холодильнике крови с антикоагулянтом EDTA улучшает стабильность общего анализа крови (Gulati G., et.al., 2002).

   В соответствии с рекомендациями Международного комитета по гематологической стандартизации, максимальные интервалы хранения для общего и лейкоцитарного подсчета с автоматическим дифференциальным подсчетом стабильны при 4°C в течение как минимум 24 ч или даже до 72 ч, при этом существенные различия зависят от типа автоматизированного анализатора клеток крови.

     Для CBC образцы можно надежно хранить в течение 24 часов. Для более длительного хранения лучшим выбором будет охлаждение (при 4 °C). Интересно, что в некоторые моменты времени (1, 2 и 4 часа) PLT немного ниже. Хранение при 4 °C показало гораздо большую стабильность. За исключением 8 часов, до 3 дней статистических изменений не было. Преимущества холодильной камеры (4 ° C) очевидны для длительного хранения. Стоит отметить, что хранение образцов более 12 часов для метаболической панели может привести к ненадежным результатам. Разные авторы сообщают, что некоторые анализы крови стабильны до 72 часов после сбора, если хранить их при 4 ° C в холодильнике.

   Повреждение эритроцитов при хранении тесно связано с их внутренним энергетическим метаболизмом. Поскольку в эритроцитах нет митохондрий, полностью зависящих от гликолиза для получения энергии, молочная кислота, образующаяся в процессе гликолиза, будет снижать внутреннее значение рН клеток, тем самым снижая уровень метаболизма клеток и уменьшая производство АТP, что приводит к снижению уровня фосфорилирования фосфопротеинов и утрате деформируемости клеточной мембраны. Снижение уровня АТP в свою очередь уменьшает синтез 2,3-дифосфоглицериновой кислоты, а уменьшение значения рН и концентрации 2-магне3-дифосфоглицериновой кислоты сдвигает кривую кислородной диссоциации гемоглобина влево. АТP также является агонистом NO-синтазы. NO и гемоглобин в эритроцитах объединяются с образованием SNOHb и Hb(Fe~II) NO, которые участвуют в транспорте и метаболизме NO. Уменьшение АТP также влияет на ионный насос на клеточной мембране, что приводит к увеличению уровня К + в депонированной крови (Li L., et.al., 2022).

     Некоторые параметры, связанные с эритроцитами, такие как RBC, HB и MCHC менее стабильны при хранении при 4 °C, на что может повлиять первоначальное замораживание с последующим охлаждением (Lombardi G., et al., 2011). RDW значительно увеличивается после 24-часового хранения при комнатной температуре. Возможной причиной этого изменения может быть повышенный MCV (de Baca M., et.al., 2006).

    По данным D. Gunawardena et.al. (2017) среди параметров CBC лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC), HB, MCH, нейтрофилы и лимфоциты стабильны при всех температурах (4 ± 2°С, 23 ± 2°С и 31 ± 2°С.) до 48 часов. Моноциты, эозинофилы, MCH, HCT и SV-RDW показали статистически значимые изменения при 23 ± 2°C и 31 ± 2°C. Значительное снижение количества тромбоцитов (PLT) и увеличение MPV и количества базофилов наблюдались при всех исследуемых температурах вплоть до 48 часов.

    Увеличение MPV наблюдается при всех температурах, причем этот показатель не считается очень стабильным для образцов крови, хранящихся в течение длительного времени. Его значения изменяются в первый период времени (1 час) и не имеют различий для температуры хранения (Wu D-W., et.al., 2017).  Четыре дня при 4 °C изменяют морфологию, движение и агрегацию тромбоцитов (Mahmoodi M., et al., 2006). MPV может иметь отношение к изменениям формы тромбоцитов, связанным со временем и формой, от дисковидной до сферической и набухания. Возможно, что тробмоциты, которые показывают повышение MPV, не будут подсчитаны машиной как тромбоциты, а будут помечены отдельно, что приведет к снижению PLT. Это говорит о том, что лучше всего оценивать PLT в течение 6 часов после забора крови.

     Во всех случаях результаты CBC обычно более стабильны, чем различные биохимические, например, метаболические панели и предоставляют надежные результаты даже через 24 часов хранения.

      Эритроциты, хранящиеся с добавлением прогестерона, имеют более высокие уровни АТP, меньший спонтанный лизис, более высокую осмотическую резистентность и более высокое поглощение метиленового синего в течение времени хранения, чем клетки, хранение которых происходит без добавления прогестерона. Этот гормон, по-видимому, находится в устойчивом равновесии между плазмой и эритроцитами в течении 42 дней хранения, и его количество в плазме почти вдвое больше, чем в клетках. После повторных промываний солевым раствором около 10% прогестерона остается прикрепленным к эритроцитам. Специфическая связь прогестерона с популяциями эритроцитов различной плотности показывает, что высокая удельная активность достигается в популяциях клеток низкой плотности (молодые клетки) в течение всего времени хранения (DeVenuto F., S M Wilson S.,1976).

.

Трансфузиология

   Во время хранения компонентов крови ex vivo биореактивные вещества, накопленные в среде хранения и вызвавшие изменения в эритроцитах, предоставили постоянные доказательства непрерывных изменений, приводящих к дисфункции эритроцитов и способны оказывать неблагоприятное воздействие на переливаемого хозяина (Gacko M., et.al., 2004). Удаление лейкоцитов и тромбоцитов как источника свободных радикалов в компонентах эритроцитов влияет на защиту оксидоредуктивного баланса в компонентах эритроцитов во время хранения.

Лейкоредуцирование или лейко-истощение относится к снижению количества лейкоцитов менее чем 5 × 10 6 остаточных донорских лейкоцитов в конечном продукте крови при сохранении 85% жизнеспособного исходного RBC.  Наличие лейкоцитов в компонентах крови является причиной нескольких осложнений.

    Лейкоредуцирование предотвращает фебрильные реакции, накопление цитокинов / хемокинов, избегая фебрильной негемолитической реакции трансфузии (FNHTR), уменьшая передачу цитомегаловируса и невосприимчивость к переливанию тромбоцитов (в концентратах тромбоцитов).

    Несмотря на использование аддитивных растворов, изменения морфологии и метаболизма эритроцитов ожидаются при хранении пакетов с кровью с лейко-редукцией и без нее. Хранение эритроцитов вызывает некоторые сложные структурные и биохимические изменения, которые называются поражением хранения эритроцитов (RCSL) 

   Биохимические изменения включают снижение активности фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) в качестве антиоксидантного фермента, увеличение везикуляции эритроцитов, потеря мембран эритроцитов, лизис мембран эритроцитов, снижение уровня 2,3-дифосфоглицерата (2,3- DPG), аденозинтрифосфат (АТФ) и снижение уровня глутатионредуктазы (GSH). Эти процессы сопровождаются снижением рН, увеличением активности фермента ЛДГ и концентрацией лактата.

  Эти изменения приводят к снижению функции и выживаемости эритроцитов после переливания. G6PD является важным ферментом в метаболизме эритроцитов и ключевым ферментом окислительного пентозофосфатного пути (PPP). В PPP никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат (NADP) превращается в его восстановленную форму, NADPH, которая необходима для GSH-опосредованной защиты от окислительного стресса поддерживая целостность эритроцитов.

    Также наблюдаются некоторые биохимические изменения концентратов эритроцитов при анаэробном гликолизе. В частности, наблюдается увеличение уровней калия (K +) и лактата и одновременное снижение уровней pH, глюкозы и натрия (Na +). Время хранения не влияет на уровни кальция (Ca ++) в концентратах RBC.

   Активность ферментов лактатдегидрогеназы и К + в эритроцитах значительно выше (в 20-160 раз), чем в плазме, и можно ожидать, что гемолиз приведет к увеличению этих аналитов.

       Cтатистически значимое увеличение активности лактат дегидрогеназы было показано в течение периода хранения в нефильтрованных эритроцитах. Активность фермента LDH в нефильтрованном эритроците по сравнению с LR-RBC увеличилась с 14-го дня хранения и была статистически признана значимой. Такие показатели, как MCV, MCH и MCHC, меньше всего влияли на хранение.  Другие авторы обнаружили, что MCV увеличился, а MCHC значительно снизился в течение периода хранения, которые оценивались каждую неделю. (Grezelbash B., et.al., 2018).

     J. Latham et al. (1982) наблюдали увеличение концентрации не только лактата, лактатдегидрогеназы, но и гемоглобина во время хранения. Консистенция свободного Hb и скорость гемолиза также были выше в нефильтрованном RBC по сравнению с LR-RBC во время хранения. Эти наблюдения указывают на возможное вовлечение лейкоцитов в большее повреждение эритроцитарной мембраны и благоприятное влияние лейкоредуцирования на качество сохраняемых единиц эритроцитов. Эти различия могут быть связаны с биологически активными веществами, такими как цитокины и гистамин, которые высвобождаются из лейкоцитов во время хранения, что оказывает непосредственное воздействие на мембрану эритроцитов и приводит к некоторым структурным и биохимическим изменениям.

     Согласно предложению Castro O., et.al. (2003), общая концентрация гемоглобина, лактатдегидрогеназа и концентрация лактата являются маркерами гемолиза.

      Sonker А. et.al. (2014) также сообщили, что лейко-фильтрованный RBC показывает меньшее повышение K +, LDH и гемолиза к концу периода хранения по сравнению с их нефильтрованными единицами. Присутствие лейкоцитов может быть причиной усиленного окислительного стресса. Эти авторы отметили, что активность ферментов LDH, гемолиз и повреждение клеточных мембран (калий, LDH, свободный гемоглобин) усиливаются в компонентах крови с высоким содержанием лимфоцитов.

Дельта – проверки

     Преаналитические ошибки, которые могут повлиять на результаты CBC, включают смешивание образцов, неправильное получение образца и нарушение целостности образца между моментом, когда образец был получен и когда он был доставлен в лаборатории. 

       Дельта-проверки — процесс маркировки различий в конкретных аналитах между последовательными анализами, являются одним из способов выявления таких проблем. Такие проверки эффективны при обнаружении некоторых вариантов преаналитических ошибок. 

    Среди обычно оцениваемых показателей CBC средний объем клеток, или MCV, и средняя концентрация клеточного гемоглобина, или MCHC, пригодны для дельта -проверок лучше всего. И тот, и другой показатель чрезвычайно стабильны в течении короткого срока — 24 часа. Например, суточный биологический коэффициент вариации MCV у здоровых людей составляет всего 0,5%.  Даже в ситуациях быстрого изменения других параметров эритроцитов, таких как острое кровоизлияние, MCV и MCHC не будут значительно изменяться в течение суток, поскольку ответ ретикулоцитов на острую кровопотерю не начинается в течение первых двух-трех дней.   За исключением переливания эритроцитов и редко острого внутрисосудистого гемолиза, нет неотложных ситуаций в состоянии пациента, которые бы значительно изменили эти показатели в краткосрочной перспективе. В случае острого гемолиза с гемоглобинемией, MCHC может быть изменен, в отличие от MCV, который будет оставаться стабильным.

    Из других проблем, связанных с анализом образца, гемолиз образца также поддается обнаружению с помощью дельта-проверок на основе MCHC. В этом сценарии RBC уменьшается, без изменений в HB и MCV, что приводит к увеличению MCHC.

     Загрязнение образцов внутривенной жидкостью и изменения количества клеток из-за свертывания образцов теоретически могут быть обнаружены дельта-проверками HB и HCT, а также изменениями значений RBC, WBC и PLT.  Однако нецелесообразно использовать дельта-проверки любого из этих показателей для обнаружения такого образца, поскольку быстрые изменения любого из них являются обычными у госпитализированных пациентов, причем, частота ложноположительных результатов будет здесь неприемлемо высокой. Тем не менее, внутривенное загрязнение приводит к пропорциональному снижению всех этих показателей.

    Следует также отметить, что выполнение дельта-проверок на MCHC имеет дополнительное преимущество для обнаружения неисправности анализатора, поскольку MCHC рассчитывается на основе трех параметров эритроцитов RBC, HB и MCV, которые измеряются непосредственно на большинстве гематологических анализаторов. Следовательно, проблемы в любом из этих измерений будут влиять на MCHC. Выбор пределов достоверности для дельта-проверок зависит от ряда факторов, в том числе от желаемого баланса чувствительности и специфичности и оцениваемой популяции пациентов. Статистический подход к дельта-проверкам может быть достигнут путем получения пар точек данных пациентов из репрезентативной популяции. Пределы, охватывающие желаемую долю населения (например, 95% или 99%), могут быть легко выбраны (Savage R., 2006).

Температура хранения

   Гемоглобин, количество эритроцитов, количество лейкоцитов, средний корпускулярный гемоглобин остаются стабильными   в течение по меньшей мере 24 часов при температуре 33 ° C. Гематокрит, средний корпускулярный объем и количество тромбоцитов стабильны в течение менее четырех часов при 33 ° C. Все вышеперечисленные параметры стабильны при 22 ° С и 4 ° С. Дифференциальная оценка HCT, MCV, PLT показала нестабильность в течение четырех часов при температуре 33 ° C.

     Некоторые параметры, связанные с эритроцитами, такие как RBC, HB и MCHC, менее стабильны при хранении при 4 ° C, поскольку на них может повлиять первоначальное замораживание с последующим охлаждением Изменение HCT и MCHC, несомненно, является следствием изменения MCV, поскольку эти параметры частично получены из последнего показателя.

Гемолиз in vitro

         Термин «гемолиз» происходит от латинского слова hemo (кровь) и лизиса (взломать) и означает разрушение клеток крови. Лаборанты обычно ограничивают значение понятия «гемолиз» эритроцитами (процесс, называемый эритролизом), которые составляют наибольший процент эритроцитов крови и игнорируют состояние других клеток крови. В связи с этим подходом методы оценки гемолиза зависят «исключительно» от измеренного количества свободного гемоглобина (fHB), выделившегося из разрушенных эритроцитов.  Напротив, небольшое количество авторов описывают «гемолиз» как разрушение всех типов клеток крови, а именно панцитолиз и заявляют, что лейкоциты и тромбоциты также могут поддвергаться гемолизу. Стоит отметить, что лейкоциты могут способствовать повышению уровня калия в состоянии лизиса.

        Гемолиз может происходить in vivo, при патологических состояниях или in vitro в связи с преаналитическими ошибками. 

          Гемолиз in vitro в преаналитической фазе является основной проблемой, с которой сталкиваются клинические лаборатории. Определяемый как разрыв мембраны эритроцита с экстравазацией гемоглобина и других внутриклеточных компонентов в окружающую плазму, гемолиз можно обнаружить визуально во время лабораторной оценки из-за изменения окраски плазмы от розового до красного после центрифугирования образца.

     Гемолиз in vitro обычно возникает в результате неадекватного забора крови, включая такие факторы, как использование игл малого диаметра, попадание остатков спирта с кожи в образец, трудности с поиском венозного доступа, маленькие и хрупкие вены, которые легко травмируются, и попытки неудовлетворительной пункции. Кроме того, неправильное обращение с образцами, такое как недостаточное заполнение пробирки для сбора, приводящее к избытку антикоагулянта, сильное встряхивание образца, воздействие чрезмерно высоких или низких температур и центрифугирование на очень высокой скорости в течение длительного периода времени, также являются факторами, которые могут нарушить структурная целостность клеток крови (Lippi G., et.al., 2008).

Факторы, способствующие гемолизу in vitro вследствие неадекватного забора крови

Использование игл малого размера

Попадание остатков спирта с кожи в образец

Трудности с поиском венозного доступа

Маленькие и хрупкие вены, которые легко травмируются

Неоднократные попытки плохой пункции

     Было показано, что с течением времени количество эритроцитов значительно снижается из-за гемолиза. Повышенная проницаемость клеток будет определяться увеличением MCV —  индекса, отражающего набухание эритроцитов. Изменение HCT и MCHC явно является следствием изменения MCV, поскольку эти параметры частично получены из MCV (Buoro S., et al., 2016).

    В работе G. de Longe et.al. (2018) образцы с высокой степенью гемолиза превышали спецификации качества для желаемой систематической ошибки, демонстрируя снижение эритроцитов (4,7%), гематокрита (6,6%), MCV (0,6%) и увеличение параметров: RDW (1,3%), MCH (1,5%), MCHC (2,5%) и количество тромбоцитов (36,7%). В то время как образцы с легкой степенью гемолиза имели умеренное увеличение MCH (0,6%), MCHC (0,7%) и количества тромбоцитов (1,4%). Авторами было замечено, что RCB имел погрешность -6,4% (от -22,8% до 10,0%), а HCT — погрешность -8,3% (от -25,7% до 9,2%), превышающую допустимые нормы ±1,7% для проб с высокой степенью гемолиза. Так, эти показатели могут быть занижены до 22,8% для эритроцитов и до 25,7% для HCT или завышены до 10,0% и 9,2% соответственно.

  Стоит отметить, что принцип измерения MCV сильно различается в зависимости от используемого гематологического анализатора. с помощью метода импеданса образцы с высокой степенью гемолиза могут демонстрировать умеренное изменение MCV (увеличение на 0,6%) с последующим увеличением RDW на 1,3%, что представляет собой широкий разброс примерно в 12%, оценивая пределы согласия и их доверительные интервалы.

Гемолиз образца крови, взятого для CBC

Высокая степень гемолиза

Снижение RBC (4,7%), HCT (6,6%), MCV (0,6%)

Увеличение RDW (1,3%), MCH (1,5%), MCHC (2,5%)

Отсутствии изменений HB

Увеличение PLT (36,7%)

Низкая степень гемолиза

Увеличение MCH (0,6%), MCHC (0,7%), PLT (1,4%)

    Сравнение образцов с разной степенью гемолиза показало снижение количества эритроцитов и гематокрита и увеличение средней концентрации корпускулярного гемоглобина и количества тромбоцитов в образцах с высокой степенью гемолиза. Согласно принятой клинической точке зрения, образцы с высокой степенью гемолиза превышают желаемую погрешность, демонстрируя снижение RBC, HCT и MCV, а также увеличение RDW, MCH, MCHC, PLT. Однако образцы с легкой степенью гемолиза показали лишь незначительное увеличение среднего корпускулярного гемоглобина, средней концентрации корпускулярного гемоглобина и количества тромбоцитов. (de Jonge G., et.al.,2018).

         Выяснение интерференционных механизмов гемолиза необходимо для более точного решения проблемы гемолиза in vitro. Гемолизированные образцы влияют на результаты испытаний по нескольким механизмам, таким как: композиционные помехи (из-за разницы между внутриклеточной и внеклеточной концентрацией аналитов), помехи сигнала в инструментальных измерениях и химической помехи в аналитических реакциях. Эти интерференционные механизмы могут сосуществовать в различных сочетаниях. Отказ от результатов анализа гемолизированных образцов может привести к задержке в диагностике, что угрожает безопасности пациента, а запрос дополнительного образца увеличивает рабочую нагрузку лаборанта и стоимость исследования.

     Вполне возможно, что клеточный дебрис и строма, образующиеся в результате распада эритроцитов, могут вызывать существенные аналитические помехи в подсчете тромбоцитов

5. Реагенты. Важный компонент системы «автоматизированный анализ крови» — реагенты. Часто лаборатории, купив анализатор, сталкиваются с необходимостью нести довольно ощутимые постоянные затраты на реагенты. Количество разных реагентов, используемых анализатором, существенно влияет на себестоимость и качество исследований.

Каждый конкретный тип гематологического анализатора рассчитан на свою собственную реагентную систему, однако между ними есть много общего.

Основными составляющими комплектов реагентов для гематологических анализаторов являются:

— изотонический разбавитель;

— лизирующий раствор;

— промывающий раствор (после каждой пробы);

— промывающий раствор (для качественной очистки системы);

— очищающий раствор (для экстренной очистки датчика и/или сервисных работ).

В зависимости от конкретной конструкции анализатора в базовый комплект может входить лишь часть указанных реагентов.

Изотонический разбавитель — это буферный раствор с фиксированными параметрами рН, электропроводности и осмолярности. Слово «изотонический» указывает только на одно и не самое важное свойство реагента — поддержание требуемого осмотического давления с целью обеспечения постоянства объема клеток крови. Дело в том, что эритроциты принимают тот объем, который им диктует осмолярность раствора. При увеличении осмолярности, в течение 3-5 с эритроциты сжимаются до некоторого равновесного объема. Если осмолярность раствора уменьшается, объем эритроцитов, соответственно, увеличивается. Таким образом, средний объем эритроцитов (MCV) увязывается с осмолярностью изотонического разбавителя. Использование изотонического разбавителя, не соответствующего марке анализатора, может привести к ложному завышению/занижению MCV.

Стабилизирующие добавки в изотоническом разбавителе должны обеспечивать сохранность форменных элементов крови в первом разведении в течение достаточно длительного времени. Присутствие в растворе антикоагулянта должно эффективно предотвращать образование фибриновых сгустков и агрегацию тромбоцитов.

Очень важными компонентами гематологических реагентов и, в частности, изотонических разбавителей являются антибактериальные добавки, которые препятствуют бактериальному заражению гидравлических магистралей анализаторов. Учитывая тот факт, что бактериостатики, как правило, негативно влияют на клеточные мембраны, их выбор довольно ограничен. Следует иметь в виду, что для всех гематологических анализаторов с дифференциацией лейкоцитов на три популяции основным режимом является работа с цельной кровью. В случае гематологических анализаторов, проводящих дифференциацию лейкоцитов на три популяции, изотонический разбавитель содержит специальные добавки, модифицирующие мембраны лейкоцитов. В этом случае изотонический разбавитель должен применяться в согласованной паре с соответствующим лизирующим раствором.

NB! Нельзя совмещать в пару «изотонический раствор — лизирующий реагент» компоненты от разных производителей!

Другим важнейшим реагентом является лизирующий раствор (гемолитик), который при добавлении в разведение крови вызывает лизис эритроцитов и в то же время сохраняет лейкоциты. Необходимо, чтобы гемолиз эритроцитов был качественный и полный, поскольку в гемолизате подсчитываются лейкоциты, которых первоначально примерно в 1000 раз меньше, чем эритроцитов. Для обеспечения этих свойств лизирующий раствор, как правило, содержит сложную композицию ионных поверхностно-активных соединений. Современные гемолитики обеспечивают быструю реакцию и высокую степень отделения лейкоцитов от стромы независимо от настройки дискриминатора конкретного прибора.

В анализаторах с дифференциацией лейкоцитов на три популяции лейкоциты под действием лизирующего раствора изменяют свои размеры так, что выделяются фракции лимфоцитов (первый пик лейкоцитарной гистограммы), гранулоциты (крайний правый пик лейкоцитарной гистограммы). В средней части гистограммы, в области так называемых средних клеток, расположены моноциты, базофилы и эозинофилы. Наряду с факторами пробоподготовки свойства реагентной системы оказывают существенное влияние на качество дифференциации лейкоцитов.

Промывающие растворы непосредственно не участвуют в процессе измерения, однако их свойства существенно влияют на стабильность аналитических характеристик анализаторов. Характерной особенностью гематологических анализаторов, использующих принцип Культера, является наличие счетных апертур малого диаметра. Кровь содержит в себе ряд веществ, которые имеют тенденцию осаждаться на апертуре и внутренней поверхности гидравлической системы. Это постепенно приводит к уменьшению диаметра, закупорке апертуры и ошибочным результатам. В некоторых случаях прибор просто останавливается и требует тщательной промывки. Таким образом, качество промывающих растворов влияет на долговременную стабильность работы прибора.

Промывающие растворы бывают в основном трех типов. Первый тип — растворы для мягкой промывки магистралей анализатора между пробами, они не содержат поверхностно-активных веществ (детергенты) в значительных концентрациях. К сожалению, детергентные промывающие растворы практически не удаляют белки. Поэтому для очистки от белковых осадков применяют растворы на основе гипохлорита натрия — второй тип промывающих растворов. Эти растворы являются очень сильными депротеинезаторами. Однако раствор гипохлорита натрия — очень едкое вещество, долгого контакта с ним не выдерживают детали из пластика (они трескаются), металла (подвергаются коррозии). Поэтому злоупотреблять такими растворами нельзя. Данные растворы в основном применяются в экстренных случаях, когда необходимо быстро очистить счетную апертуру, а также для сервисных работ.

Современное решение проблемы качественной промывки прибора — применение ферментативных промывающих растворов. Благодаря наличию ферментов, такие растворы эффективно удаляют адсорбированные на стенках гидравлической системы белки и другие вещества. При этом они совершенно нейтральны и не оказывают вредного действия на детали прибора. Трудность создания таких промывающих растворов заключается в известном свойстве ферментов быстро терять активность.

6. Калибровка и контроль качества. Система управления качеством любого исследования складывается из оценки адекватности каждого этапа. Общеклинический анализ крови — не исключение, этапы его выполнения во многом схожи с другими видами лабораторных исследований и отличаются только применяемыми антикоагулянтами и аналитическим оборудованием:

1. Основание для назначения анализа.

2. Подготовка пациента.

3. Взятие биологического материала.

4. Идентификация проб.

5. Обработка биологического материала с использованием антикоагулянтов.

6. Транспортировка проб.

7. Аналитическое исследование на гематологическом анализаторе.

8. Оформление бланка с результатами теста (может выполняться на самом анализаторе).

9. Оценка результата по интервалам норм.

10. Использование результатов в диагностическом процессе.

Первые 6 пунктов включаются в понятие преаналитического этапа. Анализ назначается врачом и, как правило, берется натощак. Раздел 8 руководства подробно описывает правила и условия взятия и обработки проб.

Аналитический этап

Качество результатов исследования крови на гематологических анализаторах определяется следующими факторами:

— качеством используемых реагентов;

— точностью дозирования цельной или разведенной крови;

— точностью дозирования изотонического раствора при разведении крови;

— точностью определения объема суспензии клеток, пропущенной через апертуру;

— точностью самого подсчета клеток;

— точностью определения размеров клеток;

— корректностью математических методов обработки первичных результатов измерения.

Для настройки приборов производители применяют специальные калибровочные микросферы, которые представляют собой стандартные частицы латекса, а также фиксированные эритроциты. Обычно стандарт, выпущенный одной фирмой, не совсем подходит для калибровки приборов других фирм.

Говоря о калибровке, хочется привести пример искажения результатов MCV, связанный с самим методом определения объема частицы. Если откалибровать анализатор взвесью эритроцитов, имеющих нормальную двояковогнутую форму, а затем измерить сферические клетки такого же объема, они будут восприняты как микроциты. И наоборот, если при калибровке применить сфероциты, то прибор будет регистрировать двояковогнутые нормоциты как макроциты. В коммерческих препаратах контрольной крови, применяемой для настройки приборов, эритроциты имеют сферическую форму, поэтому трудно говорить об адекватной калибровке MCV. До настоящего времени нет общепринятого стандарта для MCV.

Калибровка гематологических анализаторов представляет до сих пор не решенную до конца проблему. Если, например, для калибровки ручных методов определения гемоглобина существуют стандарты гемиглобинцианида, то признанных стандартов для калибровки счета клеток не существует. Те взвеси частиц и контрольная кровь, которые предлагают фирмы-производители для контроля своих приборов, калибраторами не являются и предназначены для проведения процедур контроля правильности положения дискриминаторов и счета импульсов. Все применяемые для «калибровки» и контроля работы приборов материалы имеют доверительные интервалы, в которые необходимо уложиться.

Если при калибровке гематологического анализатора показатели не укладываются в допустимые границы паспортных значений, необходимо исключить преаналитические ошибки: недостаточное перемешивание, отличие температуры контрольной крови, извлеченной из холодильника, от комнатной, нарушение режима хранения, приводящее к порче крови. Например, иногда приходилось наблюдать, как контрольную кровь замораживали. При замораживании наблюдается сильное занижение количества эритроцитов. Это бывает при хранении крови в старых моделях холодильников, встречающихся во многих лабораториях, рядом с морозильной камерой. Здесь температура может опускаться на несколько градусов ниже нуля, и этого достаточно для замораживания и последующего разрушения эритроцитов.

Необходимо также провести ряд мероприятий по обслуживанию прибора, по промывке и очистке апертур, затем вновь провести калибровку.

Клетки (частицы) контрольной крови должны удовлетворять следующим требованиям:

— отсутствие электропроводности;

— сопоставимость по размерам с контролируемыми клетками;

— сходная плотность;

— стабильность размеров во времени;

— химическая инертность.

Выпускаемая сегодня контрольная кровь представляет собой химеру, содержащую стабилизированные эритроциты, частицы латекса вместо лейкоцитов, тромбоциты животных и др. Поэтому стабилизированная кровь не является идеальным контрольным материалом, так как у содержащихся в ней клеток изменены размеры, форма поверхности, реологические свойства и специфическая электропроводность.

Следует заметить, что коммерческая контрольная кровь позволяет исследовать от 8-18 параметров и более. Для контроля приборов с дифференциацией лейкоцитов на 3 части используется кровь на 16-18 параметров. Однако необходимо понимать, что калиброванные латексные частицы, имитирующие лейкоциты, не реагируют на действие лизирующего раствора и при анализе не отражают правильность работы всей системы, а лишь правильность установки дискриминаторов. По сути, особого смысла в приобретении такой, более дорогой, крови нет, достаточно использовать контрольную кровь на 8-10 параметров.

Контрольная кровь применяется:

— для проверки правильности и воспроизводимости счета клеток;

— для проверки правильности разведения;

— для «калибровки» прибора.

Ежедневный контроль гематологических исследований включает исследование контрольной крови на анализаторе с каждой серией значений — в области нормы и в области низких и высоких значений. Все правила построения контрольных карт Леви-Дженнингса и оценка результатов по правилам Вестгарда применимы для работы с контрольной кровью, исследуемой на гематологических анализаторах. Поскольку коммерческая контрольная кровь до вскрытия флакона стабильна 4-6 мес, а после вскрытия — 20-30 дней, возможно и необходимо проводить ее анализ через каждые 20 проб пациентов и, конечно же, в каждой серии проб. Это позволяет:

1. Выявить отклонения в результатах исследований еще до того, как они станут клинически значимыми.

2. Получить необходимое количество результатов для более быстрого накопления статистики и построения карт, а также для оперативной оценки воспроизводимости работы прибора.

Многие современные гематологические анализаторы имеют встроенную программу оценки качества исследований, включающую построение контрольных карт.

Для повышения качества проводимых лабораторией исследований очень важно организовать не только внутрилабораторную, но и внешнюю межлабораторную систему управления качеством в форме локального, городского, федерального контроля. Внешний контроль качества позволяет справиться с наиболее трудной задачей — выявлением и устранением систематических ошибок измерений.

7. Обслуживание, консервация прибора. При эксплуатации гематологических анализаторов важную роль играет качество электрической сети и заземления. Внезапные отключения электропитания, перепады напряжения могут привести к выходу из строя микросхем и плат, сбоям в гидравлической системе, что неизбежно повлечет увеличение расходов на ремонт и обслуживание прибора. Приобретая гематологический анализатор, как и любое другое лабораторное оборудование, надо привыкнуть к необходимости затрат не только на расходные материалы, но и на такую важную «деталь», как источник бесперебойного питания с надежной стабилизацией напряжения.

Отключение электропитания на несколько часов в момент отбора и обработки пробы может привести к засорению трубок, апертур, клапанов. Это повлечет сбой дальнейшей работы, необходимость дополнительных процедур промывки и очистки прибора или даже незапланированное обслуживание прибора.

При получении прибора специалист, осуществляющий установку и обучение работе с анализатором, обязательно обратит ваше внимание на необходимость контроля фоновых значений, получаемых при счете в камерах без пробы. Многие приборы делают такой подсчет автоматически при запуске (процедура «start up»). Эта проверка фона дает уверенность в правильном определении параметров. В руководстве оператора к прибору обычно приводятся фоновые значения (табл. 1).

У большинства современных анализаторов есть процедура завершения работы («shut down»). Она позволяет удалить остатки биологического материала из системы, провести промывку прибора и подготовить его к отключению. Процедуры начала и окончания работы обязательны для выполнения.

Одно из действий прибора — заполнение счетных камер и микроотверстий моющим раствором, содержащим протеолитический фермент. Этот раствор находится в камерах несколько часов (ночь). Кровь, даже разведенная анализатором для подсчета, содержит достаточное количество белковых компонентов, постоянно оседающих на трубках, апертурном отверстии. К этим белкам прилипают микроскопические частицы, обломки клеток, бактерии. За несколько десятков циклов счета эта белково-детритная «пленка» может значительно увеличиться и привести к уменьшению диаметра отверстия. В результате — нарушение правильности подсчета (см. рис ).

Фермент, входящий в состав промывающего (моющего, очищающего) раствора, за несколько часов полностью растворяет белковую матрицу пленки и прибор вновь готов к работе.

Неукоснительное выполнение процедуры выключения является одним из факторов нормальной работы гематологического анализатора. Прибор, эксплуатируемый круглосуточно, не подвергается ферментативной очистке, что может привести к значительному изменению диаметра апертуры и нарушению счета. В таком отверстии могут застревать более мелкие частицы (ранее миновавшие апертуру беспрепятственно) и останавливать работу анализатора.

При закупоривании апертуры (сигнал «clog», «clogging») микросгустками, волокнами, частицами, прибор отмечает увеличение времени счета или разницу в количестве частиц, сосчитанных за несколько временны`х отрезков, в зависимости от конструкции прибора. При возникновении такой ситуации прибор обычно реализует запрограммированную процедуру автоматического устранения закупорки. Если самоочистка не приносит успеха, оператору необходимо вручную выполнить следующие действия:

— провести очистку концентрированным ферментативным раствором;

— провести очистку раствором специально приготовленного гипохлорита натрия;

— активизировать из меню прибора процедуру специальной очистки апертуры токами высокой частоты («прожиг» апертуры).

Неэффективность всех этих действий указывает на серьезную механическую закупорку микроотверстия и требует снятия и чистки апертуры в соответствии с инструкцией на прибор. В некоторых случаях может даже потребоваться вмешательство сервисной службы.

Важно помнить, что для обслуживания прибора необходимо всегда четко следовать инструкциям производителя.

Иногда, при эксплуатации гематологических анализаторов, большой проблемой становится высокий фон в канале счета тромбоцитов. Это часто наблюдается при загрязнении разбавителя штаммами бактерий, устойчивых к антибактериальным добавкам. Смена канистры с изотоническим раствором дает кратковременный успех — трубка, перенесенная из одной канистры в другую, заселяет микроорганизмами новую канистру. Через некоторое время бактерии размножаются и фон снова увеличивается. Эта ситуация требует полной дезинфекции гидравлических магистралей прибора, а иногда и замены состава реагентов и антибактериальных добавок в них.

Другой причиной увеличения фона и ложного цитоза может стать рост бактерий и попадание их в счетные камеры по трубкам слива от емкости отходов («waste»). Поверхности от камер до контейнера с отходами покрываются белково-липидной пленкой, на которой, как на питательной среде из агара, прорастают микроорганизмы. Несмотря на антибактериальные добавки, содержащиеся в дилюенте, бактерии быстро размножаются в банке с отходами и «дорастают» до камер счета. Для предотвращения этой проблемы необходимо:

1. Чаще опорожнять емкость с отходами.

2. Периодически проводить дезинфекцию емкости и сливных шлангов (о частоте и способе запросите инструкции у вашей сервисной службы).

3. НЕ ДОПУСКАТЬ соприкосновения конца сливного шланга с поверхностью отходов в канистре.

Консервация прибора

Гематологический анализатор, как и любой прибор, приобретается для того, чтобы работать непрерывно и избавлять лабораторию от трудоемких ручных операций. Приобретение анализатора является осознанной необходимостью. Ситуация с остановкой прибора из-за недостатка финансирования покупки расходных материалов — нонсенс, но встречается часто.

Если все же работу прибора приходится остановить, самое главное — это подготовить анализатор к длительному простою.

Большинство гематологических анализаторов можно остановить не более чем на одну неделю почти без последствий (летом, в жару, опаснее). Более долгий период простоя прибора с реагентами внутри системы приводит к размножению бактерий, высыханию солевых растворов, склеиванию трубок, прижатых клапанами, кристаллизации солей в апертурах, микротрубках. Привести прибор в рабочее состояние после такого безответственного отношения к нему требует множества сил и времени. Случаи оставления приборов с растворами не являются гарантийными, и пользователь вынужден будет оплачивать услуги сервисной службы в гарантийный срок, если не выполнит нескольких простых действий.

Эти действия чаще описаны в руководстве оператора или могут быть запрошены у сервис-инженеров. Процедура консервации в общих чертах выполняется с использованием соответствующих команд меню анализатора следующим образом:

1. Произвести очистку апертур, камер, трубок, гидравлической системы дезинфицирующим раствором (гипохлоритом).

2. Слить из жидкостной системы все реагенты (изотонический разбавитель, лизирующий и моющий растворы).

3. Промыть систему дистиллированной водой.

4. Осушить систему, прокачав воздух.

Теперь прибор готов к длительному ожиданию следующей поставки реагентов.

Совет: если есть небольшой запас изотонического разбавителя и поставка реагентов ожидается в ближайшее время, лучше прекратить выполнять анализы. Прибор необходимо включать и выключать 2-3 раза в неделю, выполняя процедуры начала и окончания рабочего дня («start up» и «shut down») с оставшимися растворами. Это будет поддерживать прибор в рабочем состоянии до поступления новой партии реактивов. Не следует проводить описанные процедуры с использованием дистиллированной воды, в ней нет антибактериальных добавок, прибор в этом случае может стать инкубатором для бактерий и грибков.

8. Преаналитика, ошибки и проблемы. Даже при наличии современного гематологического анализатора лаборатория иногда выдает результаты, не отражающие истинное состояние пациента, вводящие в заблуждение лечащих врачей. Денег в прибор вложено много, а результат не всегда удовлетворительный. В чем причина?

От 70 до 80% лабораторных ошибок связаны с нарушениями на преаналитическом этапе, ошибки аналитического этапа составляют 10-15%, постаналитического — 15-20%.

Ошибки внелабораторного этапа отличают случайность, бессистемность и трудноуловимость. Именно внелабораторные ошибки вносят самый весомый вклад в искажение результатов анализа, маскируются под проблемы, связанные с приборами и реагентами. В таких случаях несоответствие результатов клинической картине или результатам предыдущего обследования заставляет сотрудников лаборатории перепроверять аппаратуру или заменять реагенты. Это приводит к нерациональной трате рабочего времени и средств, а выявить истинную причину проблемы, как правило, не удается.

Взятие образца, его транспортировка, хранение требуют постоянного контроля со стороны лаборатории. Для получения качественных результатов необходимо учитывать присутствие в пробе интерферирующих веществ, индивидуальные особенности пациента, его подготовку к взятию пробы на анализ. Усилия по предотвращению ошибок на этом этапе окупятся ощутимым улучшением качества гематологических исследований, снижением необоснованных повторов, расходов рабочего времени и средств на обследование больного.

Только полностью стандартизуя все этапы гематологического, да и любого другого исследования от назначения до интерпретации результатов, можно ожидать получения адекватных данных.

Техника взятия крови, используемые иглы, скарификаторы, капилляры, пробирки для транспортировки и хранения проб, реагенты и аналитические системы — все должно быть «однородным» изо дня в день. Часть проблем устраняется с внедрением коммерческих систем взятия венозной и капиллярной крови (вакуумных и невакуумных пробирок с антикоагулянтами).

Материал для анализа. Вена или палец?

Наилучшим материалом для выполнения анализа на гематологических анализаторах является венозная кровь. Несмотря на распространенное среди медицинских работников отечественных ЛПУ мнение, что «часто в вену лазить» плохо, во всем цивилизованном мире кровь на общий анализ у взрослых берется именно из вены. Важным подспорьем для взятия венозной крови на гемограмму стала разработка и широкое внедрение вакуумных пробирок, содержащих антикоагулянт. Принудительное всасывание крови под действием вакуума позволило использовать для венозной венепункции тонкие атравматичные иглы. Капиллярная кровь в других странах используется реже, в основном у маленьких детей, и связано это с техническими трудностями получения у них венозной крови. Очевидно, что для медицины развитых стран намного важнее получение достоверных результатов из более адекватного материала, чем лозунги об опасности венепункции. Тканевая жидкость, обрывки тканей и микросгустки в капиллярной крови — причина ошибок и сбоев анализатора.

В пробах капиллярной крови более активно происходит агрегация тромбоцитов, больше травмируются форменные элементы, Венозная же кровь, взятая в объеме 2-3 мл, может быть проанализирована повторно, из нее можно выполнить дополнительные исследования.

Взятие капиллярной крови рекомендовано:

— у новорожденных, детей младшего возраста;

— у лиц со склонностью к венозному тромбозу;

— при обширных ожогах и выраженном ожирении;

— при мелких и труднодоступных венах.

На преаналитическом этапе взятия биологического материала имеется более сотни (!) условий, регламентирующих получение адекватных результатов.

Взятие венозной крови как метод выбора имеет свои правила и ограничения, обсуждаемые в специальной литературе. Стоит напомнить, что для исключения общих факторов, влияющих на результаты гематологического исследования, необходимо соблюдение следующего:

— кровь берется после 15-минутного отдыха пациента;

— исключается прием алкоголя и курение непосредственно перед исследованием;

— кровь берется натощак, утром (7-9 ч), пациент во время процедуры сидит или лежит;

— наложение жгута на руку более чем на 1 мин приводит к сосудистому стазу и завышению уровня гемоглобина в венозной крови;

— для взятия венозной крови необходимо избегать мест травм, шрамов, гематом; вен, используемых для переливания растворов; ножных вен у больных диабетом, при нарушениях периферического кровотока, ангиопатиях.

Антикоагулянт

Стабилизация крови, анализируемой на автоматических счетчиках, проводится натриевыми или калиевыми солями этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА — этилендиаминтетраацетат). Гепарин и цитрат натрия для этих целей не применяется. Кровь, стабилизированная цитратом натрия, используется при исследовании гемостаза и СОЭ.

Обычно указываемая в справочниках и инструкциях к приборам концентрация ЭДТА — 1-2 мг на 1 мл для венозной крови. В случае капиллярной крови концентрация антикоагулянта должна быть увеличена в 2-3 раза. Увеличение концентрации ЭДТА в 5 раз не опасно и приводит лишь к небольшому снижению MCV, но увлекаться не стоит.

Одно из важных условий получения качественного образца — тщательное перемешивание крови с антикоагулянтом. Имеет значение и форма нанесения антикоагулянта. Лучшие результаты дает применение пробирок с аэрозольным покрытием и мелкодисперсным порошковым напылением. Кристаллическая форма солей ЭДТА плохо растворима в крови. Применение кристаллических солей приводит к образованию фибриновых нитей в верхней части пробы крови.

Для предотвращения свертывания крови пробирку следует перевернуть, НЕ ВСТРЯХИВАЯ (!), около 10 раз.

Недостаток антикоагулянта в пробе (крови взято больше отмеченного на пробирке уровня) приводит к образованию микросгустков и нарушению работы прибора. Избыток антикоагулянта может повлиять на некоторые показатели только при очень большом превышении оптимальной концентрации.

Анализ СОЭ может быть выполнен из крови, стабилизированной ЭДТА.

Все, как обычно: 4 части крови смешать с 1 частью 3,8% раствора цитрата или физиологического раствора, выдержать 60 мин в капилляре, измерить.

Из стабилизированной ЭДТА можно приготовить мазки крови для подсчета лейкоформулы, но как можно быстрее от момента получения крови.

Авторы надеются, что в самое ближайшее время во всех отечественных лабораториях методы взятия венозной и капиллярной крови с использованием стандартизованных коммерческих систем, обработанных антикоагулянтом, станут нормой жизни. Медицинским сестрам, сопротивляющимся внедрению взятия крови на общий анализ из вены («мы не будем работать на лабораторию!»), необходимо помнить, что вся деятельность учреждений здравоохранения и персонала больниц и поликлиник направлена, в первую очередь, на благо пациента.

Безопасность

Взятие венозной крови с помощью вакуумных систем также называют бесконтактным методом. При работе с вакуумными пробирками, кроме всех прочих преимуществ, отсутствует контакт медицинского персонала с кровью (как при взятии через обычную иглу в пробирку) и, особенно, с аэрозолями крови, образующимися в большом количестве при взятии шприцем. Этот самый излюбленный метод, когда кровь струей устремляется в пробирку (травмирование клеток, гемолиз и пр.), одновременно является и самым опасным, самым «грязным» способом!

Кроме того, взятие крови шприцем с последующим разливанием аликвот по пробиркам вообще недопустимо из-за опасности образования микросгустков, травмирования иглой оператора, высокой вероятности попадания следов крови на руки медсестры, окружающие предметы!

Лозунги о недостатке средств на одноразовые изделия для взятия крови, исключающие преаналитические ошибки, меркнут перед статистикой заражения медицинского персонала вирусным гепатитом. Качество лабораторных исследований и безопасность работников здравоохранения должны чего-то стоить!

Кроме этих систем: стерильные одноразовые пособия: иглы, скарификаторы, перчатки, салфетки. Все, как всегда, плюс маски, дезрастворы, система утилизации.

Салфетки

Взятие крови для автоматического гематологического анализатора возможно только с использованием безворсовых материалов.

Никакой ваты для обработки кожи! Ворсинки ваты вместе с кровью попадают в гемоглобиновую и счетные камеры анализатора, нарушают точность и воспроизводимость анализа, это приводит к увеличению расхода реагентов (повторные промывки) и необходимости внепланового технического обслуживания прибора. Экономия на салфетках оборачивается увеличением затрат на ликвидацию последствий экономии.

Специальные салфетки, пропитанные дезинфицирующими составами и упакованные в индивидуальные пакеты в заводских условиях, — лучшая альтернатива ватным и марлевым шарикам.

Пробирки из пластика являются единственно возможными при взятии крови для последующей обработки на анализаторе.

Кровь, взятая в правильном соотношении с адекватным антикоагулянтом в пластиковую пробирку, сохраняется несколько часов (до 24 ч при 4 °С) без существенных изменений количества и морфологии клеток. Однако скорейшее выполнение анализа предпочтительно, так как патологические клетки менее устойчивы к хранению.

Контакт со стеклом, как и недостаточное количество антикоагулянта, неизбежно приводит к активации тромбоцитов и их агрегации. Результат агрегации — ложная «преаналитическая» тромбоцитопения 50-80·10⁹/л, ошибка счета лейкоцитов может достигать 150% (ложный лейкоцитоз/лимфоцитоз), число эритроцитов может быть завышено почти на 0,5 Т/л, отсюда — неправильно рассчитанные эритроцитарные индексы. Это же может наблюдаться при появлении в кровотоке гигантских форм тромбоцитов, фрагментов мегакариоцитов, но уже относится к факторам физиологии пациента.

Кровь в пластиковых пробирках значительно меньше подвергается травмированию при транспортировке.

Как только цельная кровь взята в пробирку с антикоагулянтом и установлена в штатив, запускается процесс седиментации клеток (подобный СОЭ). Уже в первые минуты стояния образца эритроциты продолжают беспорядочно перемещаться и агрегируют с образованием «монетных столбиков». Спустя 4 мин эритроцитарные агрегаты состоят примерно из 10 эритроцитов, далее они постепенно становятся крупнее (до 50 и более эритроцитов) и разветвляются.

При хранении пробирок со стабилизированной кровью в вертикальном положении появляется лейкоцитарная пленка, состоящая из лейкоцитов и тромбоцитов. Они скапливаются на границе между эритроцитами и плазмой. Недостаточное перемешивание осевшей крови может стать одним из наиболее серьезных источников погрешности при анализе.

Пробирки типа «эппендорф»

В некоторых лабораториях кровь берут в эти «микроконические» пробирки. Цельная кровь имеет высокую вязкость, качественно перемешать ее в пробирке типа «эппендорф» очень трудно. После оседания клеток крови в этот маленький конус оператор может погрузить пробоотборник в более жидкую или более густую фракцию. Результатом будет неправильный счет. Поэтому специалисты не рекомендуют такие пробирки для гематологических исследований.

Нельзя трясти пробу крови! Ручное перемешивание даже в круглодонных микропробирках — процесс с большой долей человеческого фактора — источник ошибок.

Качественное перемешивание пробы возможно с использованием специальных гематологических миксеров. Эффект от приобретения дорогого анализатора часто сводится к нулю из-за экономии нескольких сотен рублей на покупке ротационного или качающего пробирки устройства (шейкера, гематологического миксера).

Продолжительность перемешивания до непосредственного анализа крови должна составлять не менее нескольких минут. Это время зависит от скорости перемешивания, конфигурации пробирок, вязкости крови и других факторов, но в среднем должно составлять не менее 2 мин.

Необходимо помнить, что длительное перемешивание может привести к травмированию и распаду патологических клеток.

Правильное решение проблемы — применение уже упоминавшихся вакуумных пробирок, гематологического миксера и приборов с автоматической системой отбора пробы (автосамплера).

Для преаналитического и аналитического этапов гематологического анализа оптимально:

— применение одноразовых безворсовых салфеток, обработанных дезинфицирующим составом;

— применение одноразовых стерильных вакуумных систем для венозной и микропробирок для капиллярной крови;

— применение перемешивающих устройств для гомогенизации крови или приставки-автосамплера к прибору.

Одноразовые системы для взятия крови не только обеспечивают качество исследований, но и помогают соблюдать санитарно-эпидемиологические требования.

Использование вакуумных систем позволяет:

— снизить опасность возможного инфицирования персонала при работе с кровью (так как кровь сразу же из вены поступает в герметично закрытую пробирку), конструкция систем полностью исключает контакт крови пациента с окружающей средой;

— повысить достоверность результата анализа за счет исключения ошибок преаналитического этапа, связанных с транспортировкой и центрифугированием пробирок;

— обеспечить сохранность проб, исключить разбивание пробирок при транспортировке и центрифугировании и уменьшить риск соприкосновения с кровью при порезе колотым краем стеклянной пробирки; отсутствует необходимость уравновешивания пробирок при центрифугировании;

— исключить ошибки идентификации пациента, пробирки снабжены этикеткой для маркировки;

— соблюсти